Name: in vitro biochemical assays using biotin labels to study protein-nucleic acid interactions
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00
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私たちは、P.ジェレミー・ワン(ペンシルバニア大学)に役立つ編集と議論に感謝します。また、言語編集のためのシグリッド・エッカートに感謝します。K.Z.は、中国国家主要研究開発プログラム(2016YFA0500902、2018YFC1003500)と中国国家自然科学財団(31771653)の支援を受けました。L.Y.は、中国国立自然科学財団(81471502、31871503)と江蘇省の革新的および起業家プログラムによって支援されました。浙江医科学技術プロジェクト(2019KY499)の支援を受けました。M.L.は、中国国立自然科学財団(31771588)と1000青少年人材計画の助成金によって支援されました。

1. タンパク質製剤
<ol><li>MEIOB および MOV10 式コンストラクト<ol><li>cDNA発現を生成し、マウスMEIOB-A、C、およびE(図1A)およびMOV10を符号化する。<ol>
<li>各フラグメントに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を設定する。マウスcDNAの1 μL(C57BL/6マウス試験から)、dNTPの1μL、10μM前方プライマーの2μL、10μMの逆プライマーの2μL、DNAポリメラーゼの1μL、2x PCRバッファ...

<ol>
	<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox30+initiates+transcription+of+haploid+genes+during+late+meiosis+and+spermiogenesis+in+mouse+testes.">Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>Watanabe, T., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+of+gene+expression+by+Piwi+proteins+and+piRNAs.">Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs.</a> Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).</li><li>Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+high-throughput+screening+method+to+identify+compounds+targeting+protein-nucleic+acids+interactions.">A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).</li><li>Hwang, H., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+induced+fluorescence+enhancement+(PIFE)+for+probing+protein-nucleic+acid+interactions.">Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions.</a> Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).</li><li>Gustafsdottir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+DNA-protein+interactions+by+proximity+ligation.">In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).</li><li>Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+quantitative+EMSA+and+its+application+in+the+study+of+RNA--protein+interactions.">A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).</li><li>Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+binding+affinity+of+poly(ADP-ribose)+to+specific+binding+proteins+as+a+function+of+chain+length.">Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length.</a> Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).</li><li>Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Protocol+for+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Infrared+Fluorescent+Dye-labeled+Oligonucleotides.">An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li><li>Yan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+Nuclear+Receptor+Nur77+Inhibits+Cardiac+Hypertrophic+Response+to+Beta-Adrenergic+Stimulation.">Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+the+study+of+RNA-protein+interactions:+the+IRE/IRP+example.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Nishida, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+roles+of+mitochondrial+Papi+and+Zucchini+in+Bombyx+germline+piRNA+biogenesis.">Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis.</a> Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).</li><li>Anders, C., Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+enzymology+of+Cas9.">In vitro enzymology of Cas9.</a> Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).</li><li>Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+plant+in+vitro+assay+system+for+pre-mRNA+cleavage+during+3'-end+formation.">A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation.</a> Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing.">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes &amp; Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li><li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+Is+a+5'+to+3'+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3'+UTRs.">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), (2014).</li><li>Talwar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEAD-box+protein+DDX43+(HAGE)+is+a+dual+RNA-DNA+helicase+and+has+a+K-homology+domain+required+for+full+nucleic+acid+unwinding+activity.">The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).</li><li>Nagy, N. M., Konya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+fast+and+slow+consecutive+processes+by+heterogeneous+isotope+exchange+using+P-32+radiotracer.">Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer.</a> Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).</li><li>Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Probes+for+ALKBH2+Allow+the+Measurement+of+DNA+Alkylation+Repair+and+Drug+Resistance+Responses.">Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses.</a> Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).</li><li>Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+biorecognition:+the+(strept)avidin-biotin+system+as+a+model+for+protein-protein+and+protein-ligand+interaction.">Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction.</a> Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).</li><li>Trippier, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+strategies+for+the+biotinylation+of+bioactive+small+molecules.">Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules.</a> ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).</li><li>Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biotin-labeled+nucleic+acids+for+protein+purification+and+agarose-based+chemiluminescent+electromobility+shift+assays.">Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Pulldown+of+Biotinylated+RNA+for+Detection+of+Protein-RNA+Complexes.">Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes.</a> Bio-Protocol. 6 (24), (2016).</li><li>Bednarek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNAs+biotinylated+within+the+5'+cap+and+protected+against+decapping:+new+tools+to+capture+RNA+-+protein+complexes.">mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes.</a> Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).</li><li>Souquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIOB+Targets+Single-Strand+DNA+and+Is+Necessary+for+Meiotic+Recombination.">MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination.</a> Plos Genetics. 9 (9), (2013).</li><li>Luo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIOB+exhibits+single-stranded+DNA-binding+and+exonuclease+activities+and+is+essential+for+meiotic+recombination.">MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination.</a> Nature Communications. 4, 2788 (2013).</li><li>Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis-specific+proteins+MEIOB+and+SPATA22+cooperatively+associate+with+the+single-stranded+DNA-binding+replication+protein+A+complex+and+DNA+double-strand+breaks.">Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks.</a> Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).</li></ol>

タンパク質と核酸の相互作用を調べると、多様な生物学的プロセスの基礎となる分子メカニズムを理解するうえで重要です。例えば、MEIOBは、哺乳類25、26、27におけるマイオシスおよび不妊に不可欠な精巣特異的タンパク質である。MEIOBは、一本鎖DNAに結合するOBドメインを含み、3'〜5'エキソヌクレアーゼ活?...

タンパク質-核酸相互作用は、DNA修復、複製、転写、RNA処理、翻訳などの多くの必須細胞プロセスに関与しています。クロマチン内の特定のDNA配列とのタンパク質相互作用は、転写レベル1における遺伝子発現の厳密な制御のために必要とされる。多数のコードおよび非コードRNAの正確な転写後調節は、任意のタンパク質とRNA2との間の広範で複雑な相互作用を必要とする。遺伝子発現調節機構のこれらの層は、転写/エピジェネティック因子またはRNA結合タンパク質の相互作用によって調整される動的分子間イベントのカスケードを含み、ならびにその核酸標的とのRNA結合タンパク質とタンパク質とタンパク質の相互作用。生体内のタンパク質が直接または間接的に核酸と関連しているかどうかを調べるために、そのような関連がどのように起こり、終わるかを調べるために、インビトロ生化学アッセイを行い、目的のタンパク質の結合親和性または酵素活性を調べるために実施される。DNAおよび/またはRNAの設計された基板。
電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)を含む核酸タンパク質複合体を検出し、特徴付けるために多くの技術が開発され、ゲル遅滞アッセイまたはバンドシフトアッセイ3、4、5とも呼ばれる.EMSAは、核酸とのタンパク質の直接結合を研究するために広く使用されている汎用性と敏感な生化学的方法です。EMSAは、ビオチン標識6、7、蛍光標識8、9、またはによって検出するために化学発光を使用して日常的に視覚化されるバンドのゲル電気泳動シフトに依存しています。放射性32Pラベルの自動無線撮影10,11.生化学的研究の他の目的は、核酸基質からの切断産物を評価するヌクレアーゼベースの反応などのタンパク質の核酸処理活性の同定と特徴付けである12、13歳,14およびDNA/RNA構造アンワインディングアッセイは、ヘリケース活性を評価する15、16、17.
このような酵素活性アッセイでは、放射性同位体標識または蛍光色素標識核酸は、その高感度のために基質として使用されることが多い。32P標識放射トレッサーを含む酵素反応の放射線写真の分析は、敏感で再現可能であることが判明した18.しかし、世界で増加する研究室では、放射性同位体の使用は、潜在的な暴露に関連する健康上のリスクのために制限または禁止されています。バイオセーフティの懸念に加えて、放射性同位体、必要な放射能ライセンス、32Pの短い半減期(約14日間)、およびプローブ品質の徐々な劣化を行うために必要な機器が他に必要です。放射線を通して従って、代替の非同位体法が開発されている(すなわち、蛍光球でプローブを標識することで蛍光イメージング19による検出を可能にする)。しかし、蛍光標識プローブを使用する場合は、高解像度のイメージングシステムが必要です。一般的に使用される標識であるビオチンは、タンパク質や核酸などの生体高分子に容易に結合します。ビオチン連鎖生物ビンシステムは効率的に動作し、非特異的な背景20、21を増加させることなく検出感度を向上させます。EMSAに加えて、ビオチンはタンパク質精製およびRNAプルダウンに広く使用され、その中で22、23、24である。
このプロトコルは、ビオチンが一般的に使用されていない酵素反応に加えて、EMSAを含むインビトロ生化学アッセイの基質としてビオチン標識核酸を使用することに成功しました。MEIOB OBドメインが構築され、2つの変異体(切り捨ておよび点突然変異)は、GST融合タンパク質25、26、27、ならびにマウスMOV10組換えFLAG融合タンパク質16として発現される。本報告では、タンパク質精製およびビオチン標識アッセイに対するこの組み合わせプロトコルの有効性を強調する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="793">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:104px;">5242R</td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemiluminescent Imaging System</td>
			<td>Tanon, China</td>
			<td>5200</td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital sonifer</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>BBV12081048A</td>
			<td style="width:176px;">450 Watts; 50/60 HZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-dry electrophoretic blotter</td>
			<td style="width:163px;">Hoefer, USA</td>
			<td style="width:104px;">TE77XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tube Revolver&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Crystal, USA</td>
			<td style="width:104px;">3406051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">UV-light cross-linker</td>
			<td>UVP, USA</td>
			<td style="width:104px;">CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter&#160;</td>
			<td>Milipore, USA</td>
			<td>UFC801096</td>
			<td>4 ml/10 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nylon membrane</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:104px;">TG263940A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:104px;">430167</td>
			<td style="width:176px;">100 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:104px;">430597</td>
			<td style="width:176px;">150 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Microtubes tubes</td>
			<td style="width:163px;">AXYGEN, USA</td>
			<td style="width:104px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:176px;">1.5 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:104px;">430791</td>
			<td style="width:176px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>SunShine Bio, China</td>
			<td>8h288h28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Anti-FLAG M2 magnetic beads</td>
			<td style="width:163px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:104px;">M8823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">ATP</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>591136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td>
			<td>Beyotime, China</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CelLyticTM M Cell Lysis Reagent&#160;</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>107M4071V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ClonExpress II one step cloning kit&#160;</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>C112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>T1269950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dNTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>DNTP100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DMEM</td>
			<td style="width:163px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DPBS buffer</td>
			<td style="width:163px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:104px;">AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche, USA</td>
			<td style="width:104px;">04693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EndoFree Maxi Plasmid Kit&#160;</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>&#160; 
			DC202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>DC301-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FBS</td>
			<td style="width:163px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FLAG peptide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:104px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Glycerol</td>
			<td style="width:163px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:104px;">SHBK3676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GST Bulk Kit</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare, USA</td>
			<td style="width:104px;">27-4570-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>SLBZ2837</td>
			<td>1 M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KoAc</td>
			<td style="width:163px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:104px;">127-08-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamin 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:104px;">L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:104px;">AM9530G</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>AM9759 
			&#160;</td>
			<td>5 M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NP-40</td>
			<td style="width:163px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:104px;">M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:163px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:104px;">N251B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:163px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:104px;">V5591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TBE</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:104px;">15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15567027</td>
			<td>1 M, PH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15568025</td>
			<td>1 M, PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tween-20</td>
			<td style="width:163px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:104px;">A600560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro biochemical assays using biotin labels to study protein-nucleic acid interactions

タンパク質と核酸の相互作用は、転写、組み換え、RNA代謝などの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。タンパク質と核酸の相互作用を研究する実験的方法では、蛍光タグ、放射性同位体、またはその他の標識を使用して特定の標的分子を検出して分析する必要があります。非放射性核酸標識であるビオチンは、電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)で一般的に使用されていますが、核酸プロセス中のタンパク質活性を監視するために定期的に使用されていません。このプロトコルは、インビトロ酵素反応中のビオチン標識の有用性を示し、このラベルがさまざまな生化学アッセイの範囲でうまく機能することを実証する。具体的には、放射性同位体32P標識基質を用いたこれまでの知見と整合して、MEIOB(特異的にマイオティック組換えに関与するタンパク質)がDNA結合タンパク質であるビオチン標識EMSAを介して確認され、そのMOV10(RNAヘリケース)は、ビオチン標識RNA二重構造を解決し、MEIOBがビオチン標識された一本鎖DNAを切断します。本研究は、ビオチンが様々な核酸関連生化学アッセイで32Pをインビトロで置換できることを示している。

MEIOBのタンパク質構造と本研究で用いられる発現構造体を図1Aに示す。MEIOBのOBフォールドは、一本鎖核酸を認識し、相互作用することができるコンパクトなバレルのような構造です。OBドメインの1つ(aa 136-307、構築A)は、一本鎖DNA(ssDNA)、切り捨てられたタンパク質(aa 136-178切り捨て、構築C)およびMEIOBの点変異形態(R235A突然変異、構築E)を結合するDNA結合<sup cla...

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In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

ここに示すビオチン標識を用いてインビトロ生化学アッセイを用い、タンパク質-核酸相互作用の研究に広く適用可能なプロトコルを示す。

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

このプロトコルは、堅牢で信頼性が高く、効率的で手頃な価格であることが証明されたタンパク質-核酸相互作用の研究のためのビオチン標識プラットフォームを提供します。ビオチン標識核酸の同じバッチを長期間にわたって使用することができ、実験の再現性を維持する。最後に、ここで説明するすべてのビオチン標識アッセイは1日以内に実行でき、特別な装置を必要としません。この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生であるリナ・ユーです。MEIOBおよびMOV10の構造を準備し、適切な細菌に変える。MEIOBを抽出するには、遠心分離を介して細胞をペレットし、氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、またはDPBSバッファーの20ミリリットルでそれらを再懸濁します。氷の上の細菌の懸濁液を超音波処理します。次いで、12,000回gと摂氏4度で15分間の遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移します。グルタチオン-セファローズビーズを洗い流し、摂氏4度で2時間培養します。750倍gと4度でビーズをペレット化するために1分間遠心分離します。10ミリリットルの氷冷PBSでビーズを8回すすいでください。次に、溶出バッファーを1ミリリットル加え、ビーズを摂氏4度で10分間インキュベートし、遠心分離を介してビーズを溶出させます。溶出を6回繰り返し、6つの分数を一緒にプールします。溶出したタンパク質を遠心フィルターに移し、100〜200マイクロリットルの最終体積に対して7、500倍gの遠心分離によって濃縮する。MOV10を抽出するために、原稿の指示に従ってHEK293T細胞およびペレット細胞でタンパク質を発現させる。完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルで3ミリリットルの細胞ライシスバッファーでペレットを再懸濁し、氷の上で30分間インキュベートします。その後、摂氏4度でリセートを遠心分離します。K150バッファーで2回洗浄して、アンチフラッグの磁気ビーズを調製します。洗浄後、ビーズを氷冷K150バッファーの1ミリリットルに再び懸濁し、穏やかな回転で摂氏4度で2分間インキュベートします。磁石にビーズを集め、上清を取り除きます。ビーズを細胞のライセートに加え、摂氏4度で2時間インキュベートします。原稿の方向に従ってK150バッファーでビーズを洗浄し、FLAG溶出バッファーの300マイクロリットルにビーズを再懸濁します。ビーズを磁石の上に置き、MOV10タンパク質を用いて上清を集め、タンパク質濃度を決定します。各オリゴを20マイクロモルに希釈し、それらをアニールして原稿の指示に従ってRNA二重鎖を形成して、RNAオリゴヌクレオチドを調製します。MEIOB電気泳動移動性シフトアッセイ(EMSA)の場合は、原稿の指示に従って試薬を混合します。20マイクロリットルの最終的な反応量のための水を加える。反応を室温で30分間インキュベートし、次いで5倍の停止バッファーを加えます。MOV10ヘリケース活性アッセイの場合は、原稿の指示に従って試薬を混合し、20マイクロリットルの最終的な反応量のために水を加えます。37°Cで10分、30分、60分間インキュベートし、5倍の停止バッファーを加えて反応を停止します。次いで、20%天然ポリアクリルアミドゲルを調製し、各サンプルの20〜25マイクロリットルを各ウェルに負荷します。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルの下部4分の1に移行するまで、氷浴の100ボルトでゲルを実行します。アクリルアミドは有害で有毒です。適切な個人用保護具で処理することが重要です。ゲルプレートを分解し、ローディングウェルと未使用レーンを除去してゲルをトリムします。ゲルを 0.5x TBE バッファーに入れます。フィルターペーパーとナイロン膜をゲルの大きさにカットし、紙と膜を事前に濡らし、スタックを組み立てて転写します。90ミアンペアで半乾燥電気泳動装置でゲルから膜にサンプルを20分間移します。次いで、45〜60秒間、120ミリジュール/センチメートルで膜を照射することにより、試料を架橋する。化学発光検出のために、20ミリリットルのブロッキングバッファーを膜に加え、穏やかに振りながら15〜30分間インキュベートします。ブロッキングバッファーを慎重に取り外し、コンジュゲート/ブロッキング バッファーに置き換えます。膜を15分間再びインキュベートします。1回の洗浄で5分間振りながら、膜を4回洗います。次いで、膜に30ミリリットルの基質平衡バッファーを加え、20〜25rpmで振りながら5分間インキュベートする。膜の表面全体を基質の作業溶液で覆い、5分間インキュベートします。インキュベーション後、化学発光イメージングシステムで膜を1〜3秒間スキャンします。MEIOBタンパク質A、C、およびEの精製は、クマシーブルー染色およびウェスタンブロット分析で検証することができます。赤い矢印は、精製されたMEIOBタンパク質の位置を示す。MEIOBと一本鎖DNAの相互作用は、EMSAを用いて可視化することができる。濃度依存性結合および切断が観察される。予想通り、変異体MEIOB-EとMEIOB-CはDNAと相互作用しないが、野生型のMEIOB-AだけがDNAと相互作用する。MEIOBと一本鎖RNAの相互作用も観察できる。野生型MEIOBは、一本鎖RNAに対する濃度依存的結合およびエキソヌクレアーゼ活性を示す。しかし、定量比較は、MEIOBがRNAよりも高い効率でDNAを結合することを示している。MOV10の精製は、クマシーブルー染色で検証され、タンパク質のヘリカゼ活性を5素数のオーバーハングを有するRNAデュプレックスで測定した。反応時間が長くなるにつれて、MOV10は徐々に二本鎖RNAを巻き戻します。アッセイのコストを削減するために、化学発光検出は、検出キット試薬の2倍希釈または自作試薬を用いて行うことができる。ここで説明するプロトコルは、EMSAなどのインビトロ生化学アッセイやビオチンが一般的に使用されていない酵素反応の基質としてビオチン標識核酸を使用しました。

Research

JoVE Journal

Genetics

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in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

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植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

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Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

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Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

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High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

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円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

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ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

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