Name: in vitro biochemical assays using biotin labels to study protein-nucleic acid interactions
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions at JoVE.com

Agradecemos a P. Jeremy Wang (Universidad de Pensilvania) por ediciones y discusiones útiles. También agradecemos a Sigrid Eckardt por la edición de idiomas. K. Z. contó con el apoyo del Programa Nacional Clave de I+D de China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) y la National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81471502, 31871503) y el Programa Innovador e Empresarial de la Provincia de Jiangsu. J. N. contó con el apoyo de Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31771588) y el 1000 Youth Talent Plan.

1. Preparación de proteínas
<ol><li>Construcciones de expresión MEIOB y MOV10<ol><li>Generar construcciones de expresión cDNA codificando el mouse MEIOB-A, C y E (Figura1A)y MOV10.<ol>
<li>Configure las reacciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cada fragmento. Mezclar 1 l de ADNc del ratón (a partir de C57BL/6 mouse testis), 1 l de dNTP, 2 ml de imprimación hacia delante de 10 m, 2 ml de imprimación inversa de 10 m, 1 l de polimerasa de ADN, 25 m...

<ol>
	<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox30+initiates+transcription+of+haploid+genes+during+late+meiosis+and+spermiogenesis+in+mouse+testes.">Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>Watanabe, T., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+of+gene+expression+by+Piwi+proteins+and+piRNAs.">Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs.</a> Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).</li><li>Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+high-throughput+screening+method+to+identify+compounds+targeting+protein-nucleic+acids+interactions.">A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).</li><li>Hwang, H., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+induced+fluorescence+enhancement+(PIFE)+for+probing+protein-nucleic+acid+interactions.">Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions.</a> Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).</li><li>Gustafsdottir, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+Is+a+5'+to+3'+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3'+UTRs.">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), (2014).</li><li>Talwar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEAD-box+protein+DDX43+(HAGE)+is+a+dual+RNA-DNA+helicase+and+has+a+K-homology+domain+required+for+full+nucleic+acid+unwinding+activity.">The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).</li><li>Nagy, N. M., Konya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+fast+and+slow+consecutive+processes+by+heterogeneous+isotope+exchange+using+P-32+radiotracer.">Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer.</a> Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).</li><li>Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Probes+for+ALKBH2+Allow+the+Measurement+of+DNA+Alkylation+Repair+and+Drug+Resistance+Responses.">Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses.</a> Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).</li><li>Wilchek, M., Bayer, E. 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L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Pulldown+of+Biotinylated+RNA+for+Detection+of+Protein-RNA+Complexes.">Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes.</a> Bio-Protocol. 6 (24), (2016).</li><li>Bednarek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNAs+biotinylated+within+the+5'+cap+and+protected+against+decapping:+new+tools+to+capture+RNA+-+protein+complexes.">mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes.</a> Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).</li><li>Souquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIOB+Targets+Single-Strand+DNA+and+Is+Necessary+for+Meiotic+Recombination.">MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination.</a> Plos Genetics. 9 (9), (2013).</li><li>Luo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIOB+exhibits+single-stranded+DNA-binding+and+exonuclease+activities+and+is+essential+for+meiotic+recombination.">MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination.</a> Nature Communications. 4, 2788 (2013).</li><li>Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis-specific+proteins+MEIOB+and+SPATA22+cooperatively+associate+with+the+single-stranded+DNA-binding+replication+protein+A+complex+and+DNA+double-strand+breaks.">Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks.</a> Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).</li></ol>

Investigar las interacciones proteína-ácido nucleico es fundamental para nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a diversos procesos biológicos. Por ejemplo, MEIOB es una proteína específica para la meiosis y la fertilidad en mamíferos25,26,27. MEIOB contiene un dominio OB que se une al ADN de una sola cadena y exhibe una actividad de exonucleasa de 3' a 5'26,que se relaciona ...

Las interacciones entre ácido sulfúrico y proteína están involucradas en muchos procesos celulares esenciales, como la reparación del ADN, la replicación, la transcripción, el procesamiento de ARN y la traducción. Las interacciones proteicas con secuencias de ADN específicas dentro de lacromatina son necesarias para el control estricto de la expresión génica en el nivel de transcripción 1. La regulación posttranscripcional precisa de numerosos ARN de codificación yno codificación requiere interacciones extensas y complicadas entre cualquier proteína y ARN 2. Estas capas de mecanismo regulador de la expresión génica comprenden una cascada de eventos intermoleculares dinámicos, que se coordinan mediante interacciones de factores de transcripción/epigenética o proteínas de unión al ARN con sus objetivos de ácido nucleico, así como interacciones proteína-proteína. Para diseccionar si las proteínas in vivo están asociadas directa o indirectamente con ácidos nucleicos y cómo tales asociaciones se producen y culminan, se llevan a cabo ensayos bioquímicos in vitro para examinar la afinidad de unión o la actividad enzimática de las proteínas de interés sustratos diseñados de ADN y/o ARN.
Se han desarrollado muchas técnicas para detectar y caracterizar complejos de ácido-proteína nucleico, incluido el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), también llamado ensayo de retardo de gel o ensayo de cambio de banda3,4,5 . EMSA es un método bioquímico versátil y sensible que se utiliza ampliamente para estudiar la unión directa de proteínas con ácidos nucleicos. EMSA se basa en el cambio electroforético de gel en las bandas, que se visualizan rutinariamente utilizando quimioluminiscencia para detectar etiquetas de biotina6,7, la fluorescencia de las etiquetas de fluoróforo8,9,o por autoradiografía de etiquetas radiactivas de 32P10,11. Otros propósitos de los estudios bioquímicos son la identificación y caracterización de la actividad de procesamiento de ácido snúcleo de proteínas, tales como reacciones basadas en nucleasas para evaluar los productos de escisión a partir de sustratos de ácido nucleico12, 13 , 14 y ensayos de desenredado de estructura ADN/ARN para evaluar las actividades de helicaso15,16,17.
En tales ensayos de actividad enzimática, los ácidos nucleicos etiquetados con radioisótopos o con etiqueta de fluoróforo se utilizan a menudo como sustratos debido a su alta sensibilidad. Se ha encontrado que el análisis de radiografías de reacciones enzimáticas con 32Radiosondas con etiqueta P son sensibles y reproducibles18. Sin embargo, en un número cada vez mayor de laboratorios en el mundo, el uso de radioisótopos está restringido o incluso prohibido debido a los riesgos para la salud asociados con la exposición potencial. Además de los problemas de bioseguridad, otros inconvenientes son el equipo necesario para llevar a cabo el trabajo con radioisótopos, la licencia de radiactividad requerida, una vida media corta de 32P (alrededor de 14 días) y un deterioro gradual de la calidad de la sonda debido a radiolisis. Por lo tanto, se han desarrollado métodos alternativos no isotópicos (es decir, el etiquetado de la sonda con fluoróforos permite la detección por imágenes fluorescentes19). Sin embargo, se necesita un sistema de imágenes de alta resolución cuando se utilizan sondas etiquetadas fluorescentemente. La biotina, una etiqueta de uso común, se une fácilmente a macromoléculas biológicas como proteínas y ácidos nucleicos. El sistema Biotin-streptavidin funciona de manera eficiente y mejora la sensibilidad de detección sin aumentar los antecedentes no específicos20,21. Además de EMSA, la biotina es ampliamente utilizada para la purificación de proteínas y el extracción de ARN, entre otros22,23,24.
Este protocolo utiliza con éxito ácidos nucleicos etiquetados con biotina como sustratos para ensayos bioquímicos in vitro que incluyen EMSA, además de reacciones enzimáticas en las que no se ha utilizado comúnmente la biotina. El dominio MEIOB OB está construido y dos mutantes (truncamiento y mutación puntual) se expresan como proteínas de fusión GST25,26,27,así como ratón MOV10 proteína de fusión FLAG recombinante16. Este informe destaca la eficacia de este protocolo combinado para la purificación de proteínas y ensayos etiquetados con biotina con fines experimentales diversos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="793">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:104px;">5242R</td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemiluminescent Imaging System</td>
			<td>Tanon, China</td>
			<td>5200</td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital sonifer</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>BBV12081048A</td>
			<td style="width:176px;">450 Watts; 50/60 HZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-dry electrophoretic blotter</td>
			<td style="width:163px;">Hoefer, USA</td>
			<td style="width:104px;">TE77XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tube Revolver&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Crystal, USA</td>
			<td style="width:104px;">3406051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">UV-light cross-linker</td>
			<td>UVP, USA</td>
			<td style="width:104px;">CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter&#160;</td>
			<td>Milipore, USA</td>
			<td>UFC801096</td>
			<td>4 ml/10 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nylon membrane</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:104px;">TG263940A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:104px;">430167</td>
			<td style="width:176px;">100 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:104px;">430597</td>
			<td style="width:176px;">150 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Microtubes tubes</td>
			<td style="width:163px;">AXYGEN, USA</td>
			<td style="width:104px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:176px;">1.5 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:104px;">430791</td>
			<td style="width:176px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>SunShine Bio, China</td>
			<td>8h288h28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Anti-FLAG M2 magnetic beads</td>
			<td style="width:163px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:104px;">M8823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">ATP</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>591136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td>
			<td>Beyotime, China</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CelLyticTM M Cell Lysis Reagent&#160;</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>107M4071V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ClonExpress II one step cloning kit&#160;</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>C112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>T1269950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dNTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>DNTP100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DMEM</td>
			<td style="width:163px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DPBS buffer</td>
			<td style="width:163px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:104px;">AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche, USA</td>
			<td style="width:104px;">04693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EndoFree Maxi Plasmid Kit&#160;</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>&#160; 
			DC202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>DC301-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FBS</td>
			<td style="width:163px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FLAG peptide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:104px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Glycerol</td>
			<td style="width:163px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:104px;">SHBK3676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GST Bulk Kit</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare, USA</td>
			<td style="width:104px;">27-4570-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>SLBZ2837</td>
			<td>1 M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KoAc</td>
			<td style="width:163px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:104px;">127-08-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamin 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:104px;">L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:104px;">AM9530G</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>AM9759 
			&#160;</td>
			<td>5 M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NP-40</td>
			<td style="width:163px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:104px;">M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:163px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:104px;">N251B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:163px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:104px;">V5591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TBE</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:104px;">15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15567027</td>
			<td>1 M, PH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15568025</td>
			<td>1 M, PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tween-20</td>
			<td style="width:163px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:104px;">A600560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro biochemical assays using biotin labels to study protein-nucleic acid interactions

Las interacciones entre ácido sulfúrico y proteína desempeñan un papel importante en procesos biológicos como la transcripción, la recombinación y el metabolismo del ARN. Los métodos experimentales para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos requieren el uso de etiquetas fluorescentes, isótopos radiactivos u otras etiquetas para detectar y analizar moléculas diana específicas. La biotina, una etiqueta de ácido nucleico no radiactivo, se utiliza comúnmente en los ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), pero no se ha empleado regularmente para controlar la actividad proteica durante los procesos de ácido nucleico. Este protocolo ilustra la utilidad del etiquetado de la biotina durante las reacciones enzimáticas in vitro, demostrando que esta etiqueta funciona bien con una gama de diferentes ensayos bioquímicos. Específicamente, en consonancia con los hallazgos anteriores utilizando sustratos marcados con radioisótopos 32P, se confirma a través de EMSA etiquetada con biotina que MEIOB (una proteína específicamente implicada en la recombinación meiótica) es una proteína de unión al ADN, que MOV10 (una Helicase de ARN) resuelve estructuras dúplex de ARN etiquetadas con biotina, y ese MEIOB corta ADN de cadena única etiquetado por biotina. Este estudio demuestra que la biotina es capaz de sustituir 32P en diversos ensayos bioquímicos relacionados con el ácido nucleico in vitro.

La estructura proteica de MEIOB y las construcciones de expresión utilizadas en este estudio se ilustran en la Figura 1A. Los pliegues OB en MEIOB son estructuras compactas similares a barriles que pueden reconocer e interactuar con ácidos nucleicos de una sola cadena. Uno de los dominios OB (aa 136-307, construir A) une ADN trenzado único (ssDNA), la proteína truncada (aa 136-178 truncamientos, construcción C) y la forma mutante de punto (mutación R235A, construcción...

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In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Este protocolo ofrece una plataforma con etiqueta de biotina para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos que resulta ser robusta, confiable, eficiente y asequible. El mismo lote de los ácidos nucleicos con etiqueta de biotina se puede utilizar durante un largo período de tiempo, manteniendo la reproducibilidad de los experimentos. Por último, todos los ensayos con biotina-etiquetado descritos aquí se pueden realizar dentro de un día y no requieren equipo especial.Demostrando el procedimiento estará Lina Yu, un postgraduado de nuestro laboratorio. Preparar construcciones MEIOB y MOV10, y transformarlas en las bacterias apropiadas. Para extraer MEIOB, peletiza las células a través de centrifugación y resuspendlas en 20 mililitros de solución salina tamponada de Fosfato de Dulbecco, o Tampón DPBS.Sonicar la suspensión bacteriana sobre hielo. Luego, centrifugar el izado a 12.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 15 minutos, y transfiera el sobrenadante a un tubo fresco. Pre-lavado de cuentas de glutatión-sepharose, y incubar con el ésate a cuatro grados Celsius durante dos horas.Centrifugar la mezcla a 750 veces g y cuatro grados Celsius durante un minuto para peletizar las perlas. Enjuague las cuentas con 10 mililitros de PBS helado ocho veces. Luego, agregue un mililitro de tampón de elución, incubar las cuentas a cuatro grados Celsius durante 10 minutos, y eluir las cuentas a través de la centrifugación.Repite la elución seis veces, y agrupa las seis fracciones. Transfiera las proteínas eluidas a un filtro centrífugo y concéntrese por centrifugación a 7.500 veces g para un volumen final de 100 a 200 microlitros. Para extraer MOV10, expresar la proteína en células HEK293T y peletizar las células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Resuspender el pellet en tres mililitros de tampón de lelisis celular con cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA completo, e incubar durante 30 minutos sobre hielo. Luego, centrifugar el izado a cuatro grados centígrados. Prepare perlas magnéticas anti-FLAG lavándolas dos veces con tampón K150.Después del lavado, resuspender las cuentas en un mililitro de tampón K150 helado y incubarlas durante dos minutos a cuatro grados centígrados con rotación suave. Recoger las cuentas en un imán, y quitar el sobrenadante. Agregue las cuentas al lesato celular e incubar a cuatro grados centígrados durante dos horas.Lave las perlas con Tampón K150 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y resusppend las cuentas en 300 microlitros de tampón de elución FLAG. Coloque las perlas en un imán, recoja el sobrenadante con las proteínas MOV10 y determine la concentración de proteínas. Preparar los oligonucleótidos de ARN diluyendo cada oligo a 20 micromolares y recocido para formar dúplex de ARN de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Para el ensayo de cambio de movilidad electroforética MEIOB, o EMSA, mezcle los reactivos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Añadir agua para un volumen de reacción final de 20 microlitros. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego añadir 5x tampón de parada.Para el ensayo de actividad de helicasa MOV10, mezcle los reactivos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y agregue agua para un volumen de reacción final de 20 microlitros. Incubar la reacción a 37 grados centígrados durante 10 minutos, 30 minutos y 60 minutos, y luego añadir 5x tampón de parada para detener la reacción. A continuación, prepare un gel de poliacrilamida nativo del 20% y cargue de 20 a 25 microlitros de cada muestra en cada pocóyo.Ejecuta el gel a 100 voltios en un baño de hielo hasta que el marcador azul de bromofenol haya migrado al cuarto inferior del gel. La acrilamida es dañina y tóxica. Es importante manejarlo con el equipo de protección personal adecuado.Desmontar las placas de gel, y recortar el gel mediante la eliminación de los pozos de carga y carriles no utilizados. Coloque el gel en un tampón TBE de 0,5x. Corte el papel del filtro y la membrana de nylon al tamaño del gel, humedezca previamente el papel y la membrana, y ensamble la pila para su transferencia.Transfiera las muestras del gel a la membrana en un aparato electroforético semisequedo a 90 miliamperios durante 20 minutos. Luego, entrecruza las muestras irradiando la membrana a 120 mililijoules por centímetro cuadrado durante 45 a 60 segundos. Para la detección de quimiuminoscencia, comience agregando 20 mililitros de tampón de bloqueo a la membrana e incubando durante 15 a 30 minutos mientras agita suavemente.Retire cuidadosamente el búfer de bloqueo y reemplácelo por búfer conjugado/bloqueo. Incubar la membrana de nuevo durante 15 minutos. Lave la membrana cuatro veces mientras agita durante cinco minutos por lavado.Luego, agregue 30 mililitros de tampón de equilibrio de sustrato a la membrana, e incubarlo durante cinco minutos mientras agita a 20 a 25 rpm. Cubrir toda la superficie de la membrana con solución de trabajo del sustrato, e incubar durante cinco minutos. Después de la incubación, escanee la membrana en un sistema de imágenes quimiominiscentes durante uno a tres segundos.La purificación de las proteínas MEIOB A, C y E se puede verificar con la tinción azul de Coomassie y el análisis de manchas occidentales. Las flechas rojas indican las posiciones de las proteínas MEIOB purificadas. Las interacciones de MEIOB y adn de una sola cadena se pueden visualizar utilizando EMSA.Se observan la unión dependiente de la concentración y el escote. Como era de esperar, sólo el tipo salvaje MEIOB-A interactúa con el ADN, mientras que el mutante MEIOB-E y MEIOB-C no lo hacen. También se pueden observar interacciones de MEIOB y ARN de una sola cadena.La MEIOB de tipo salvaje muestra la unión dependiente de la concentración y la actividad de la exonucleasa en el ARN de una sola cadena. Sin embargo, la comparación cuantitativa muestra que MEIOB une el ADN con una eficiencia mayor que el ARN. La purificación de MOV10 se verificó con la tinción azul de Coomassie, y la actividad helicasa de la proteína se midió en un dúplex de ARN con un voladizo de cinco primos.A medida que aumenta el tiempo de reacción, MOV10 desenrolla progresivamente el ARN de doble cadena. Para reducir el costo del ensayo, la detección de quimiuminescencia se puede realizar con una dilución doble de los reactivos del kit de detección o con reactivos hechos a sí mismos. El protocolo descrito aquí utilizó con éxito ácidos nucleicos con etiqueta de biotina como sustratos para ensayos bioquímicos in vitro como EMSA y para reacciones enzimáticas en las que la biotina no se ha utilizado comúnmente.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Investigación

Genética

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Ingeniería genética de un levaduras no convencionales para biocombustible renovable y producción bioquímica

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

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La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Desplegable base de biotina de ensayo a validar mRNA miRNAs objetivos de celular

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...