Name: in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts
Uploaded: 2019-08-14T14:00:00
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Ringraziamo Alhad Mahagaonkar per aver gestito la struttura di pesce zebra dell'Università di Auckland e l'Unità di Ricerca Biomedica Imaging, Scuola di Scienze Mediche, Università di Auckland, per assistenza nella microscopia confocale time-lapse. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di progetto del Consiglio per la ricerca sanitaria della Nuova èelanda (14/105), una sovvenzione per il progetto Marsden Fund (UOA1602) della Royal Society of Neozelandese e una sovvenzione per il progetto Auckland Medical Research Foundation (1116012) assegnato a J.W.A.

1. Preparazione degli aghi di microiniezione
<ol><li>Accendere un tiratore di micropipette e impostare i seguenti parametri (calibrato per il modello di espellere micropipette elencato nella Tabella dei materiali): Calore, 680; Tirare, 75; Velocità, 40; Tempo, 55; Pressione: 530.</li>
	<li>Fissare un capillare di vetro borosilicato nell'eschetto micropipette e tirare il capillare per fare due aghi. Ripetere l'operazione per tutti gli aghi desiderati.</li>
</ol>2. Coltura cellular...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sunitinib+acts+primarily+on+tumor+endothelium+rather+than+tumor+cells+to+inhibit+the+growth+of+renal+cell+carcinoma.">Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).</li><li>Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+tumor+xenografts+induce+neovascularization+in+zebrafish+embryos.">Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos.</a> Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish.">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegfd+can+compensate+for+loss+of+Vegfc+in+zebrafish+facial+lymphatic+sprouting.">Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting.</a> Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).</li><li>Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barbigerone+inhibits+tumor+angiogenesis,+growth+and+metastasis+in+melanoma.">Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKLB1002,+a+novel+potent+inhibitor+of+VEGF+receptor+2+signaling,+inhibits+angiogenesis+and+tumor+growth+in+vivo.">SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).</li><li>Muthukumarasamy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noreremophilane-based+inhibitors+of+angiogenesis+using+zebrafish+assays.">Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).</li><li>Britto, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+enhance+Vegfa-driven+angiogenesis+in+an+embryonic+zebrafish+tumor+xenograft+model.">Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (12), (2018).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NXT2+is+required+for+embryonic+heart+development+in+zebrafish.">NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Eng, T. C. Y., Astin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Zebrafish+Facial+Lymphatics.">Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics.</a> Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors.">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768 (2011).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRN951,+a+highly+potent+inhibitor+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+tyrosine+kinases,+has+antitumor+activities+and+affects+functional+vascular+properties.">KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties.</a> Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+inflammatory+lymphangiogenesis.">A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis.</a> Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).</li><li>Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+architecture+of+human+xenotransplanted+tumors:+histological,+morphometrical,+and+ultrastructural+studies.">The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).</li><li>Vermeulen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+quantification+in+primary+colorectal+carcinoma:+an+immunohistochemical+study.">Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study.</a> British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).</li><li>Heilmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+System+for+Studying+Metastasis+Using+Transparent+Zebrafish.">A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish.</a> Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).</li><li>Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Zebrafish+to+Identify+Anti-(Lymph)Angiogenic+Compounds+for+Cancer+Treatment:+Promise+and+Future+Challenges.">Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges.</a> Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cords+Promote+Tumor+Initial+Growth+prior+to+Vascular+Function+through+a+Paracrine+Mechanism.">Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism.</a> Scientific Reports. 6, 19404 (2016).</li><li>Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+normalization+as+a+therapeutic+strategy+for+malignant+and+nonmalignant+disease.">Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).</li><li>Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+vascular+networks+in+zebrafish:+an+introduction+to+microangiography.">Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography.</a> Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).</li></ol>

Il primo passo critico nel protocollo è l'impianto delle cellule tumorali. È essenziale che le cellule vengano iniettate in un luogo che consenta allo xenotrapianto di impiantare con successo nell'embrione senza rendere l'embrione edematoso. Un'iniezione troppo anteriore può permettere alle cellule di muoversi verso il cuore, bloccando il flusso sanguigno e portando all'edema, mentre un'iniezione troppo posteriore si tradurrà in uno xenotrapianto impiantato male. Un'iniezione anteriore è meglio evitare inserendo l'a...

L'angiogenesi è uno dei segni distintivi classici del cancro e rappresenta un obiettivo della terapia anti-cancro1,2. Per studiare questo processo, sono stati creati modelli di xenotrapianto di cancro impiantando cellule tumorali di mammiferi in animali come i topi3. È stato inoltre sviluppato un modello di xenotrapianto di pesce zebra, che prevede l'impianto di cellule tumorali in 2 giorni dopo la fecondazione (dpi) pesce zebra che si traduce in una rapida crescita dei vasi sanguigni del pesce zebra nello xenotrapianto4.
Questo protocollo descrive un modello di xenotrapianto dell'embrione di pesce zebra in vivo in cui la risposta angiogenica può essere quantificata con precisione nell'intero xenotrapianto. Questo metodo consente allo sperimentatore di esaminare, in vivo, i meccanismi molecolari alla base della risposta angiogenica tumorale. La trattatibilità genetica del pesce zebra permette di interrogare il contributo dell'ospite, mentre la selezione didiverse linee cellulari tumorali permette di esaminare anche il contributo del tumore all'angiogenesi 5,6,7. Inoltre, poiché le larve di pesce zebra sono permeabili a piccole molecole, è possibile utilizzare inibitori specifici della via o vagliare le librerie di farmaci per identificare nuovi inibitori dell'angiogenesi tumorale8,9,10, 11.
Il modello xenotrapianto embrionale di zebra presenta vantaggi unici rispetto ad altri modelli di xenotrapianto mammifero. Gli xenografi di pesce zebra sono più economici e più facili da eseguire, è possibile esaminare un gran numero di animali e l'imaging delle cellule vive consente un esame dettagliato del comportamento cellulare4. A differenza di altri modelli in vivo, che richiedono fino a diverse settimane per osservare una crescita significativa del vaso, l'angiogenesi negli xenografi del pesce zebra può essere osservata entro 24 h dopo l'impianto3,4. Tuttavia, la mancanza di un sistema immunitario adattivo nel pesce zebra embrionale, pur conile nel mantenimento dello xenotrapianto, significa che la risposta immunitaria adattativa e il suo contributo all'angiogenesi tumorale non possono essere esaminati. Inoltre, la mancanza di cellule stromali tumorali, l'incapacità di impiantare ortotopicamente il tumore e la differenza di temperatura di mantenimento tra il pesce zebra e le cellule dei mammiferi sono potenziali punti deboli di questo metodo. Ciò nonostante, l'amenabilità di questo modello per l'imaging dal vivo e la capacità di quantificare con precisione la risposta angiogenica lo rende particolarmente vantaggioso per lo studio dei processi cellulari che regolano l'angiogenesi tumorale in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>011G</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillaries</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100T-4</td>
			<td>OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -35 mm diameter</td>
			<td>Thermofisher NZ</td>
			<td>NUN153066</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -100 mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167-500EA</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>In Vitro Technologies</td>
			<td>COR430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 &#956;M in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Drug treatment, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 
			 
			1.6 g KCl 
			 
			5.8 g CaCl2&#183;2H2O 
			 
			9.78 g MgCl2&#183;6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH</td>
			<td>In house [1]</td>
			<td></td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Xenotransplantation, Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1491</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1489</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 10 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1487</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Preparation of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (NZ origin)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10091148</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer</td>
			<td>HawksleyVet</td>
			<td>AC1000</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75004500</td>
			<td>Cell culture, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 &#956;g/ml in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point, UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methycellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9004 67 5</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader 0.5-20 &#956;L pipette tip for loading microcapillaries</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller P 87</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3516</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Media (MEM) - alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>12561056</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narishige micromanipulator</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 pipet filler</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>9501</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4485</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 2 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4486</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Needle 22 gauge</td>
			<td>Amtech</td>
			<td>SH 182</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>HeraCell 150i</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tivozanib (AV951)</td>
			<td>AVEO Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Drug treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3 mL</td>
			<td>Mediray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.25% )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Software (v6.3)</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts

L'angiogenesi tumorale è un obiettivo chiave della terapia anti-cancro e questo metodo è stato sviluppato per fornire un nuovo modello per studiare questo processo in vivo. Uno xenotrapianto di pesce zebra viene creato impiantando cellule tumorali dei mammiferi nello spazio perivitelline di due giorni dopo la fecondazione degli embrioni di pesce zebra, seguito misurando l'entità della risposta angiogenica osservata in un endpoint sperimentale fino a due giorni post-impianto. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di quantizzare con precisione la risposta angiogenica dell'ospite del pesce zebra all'innesto. Ciò consente un esame dettagliato dei meccanismi molecolari e del contributo ospite vs tumorale alla risposta angiogenica. Gli embrioni xenointrapsi a possono essere sottoposti a una varietà di trattamenti, come l'incubazione con potenziali farmaci anti-angiogenesi, al fine di studiare strategie per inibire l'angiogenesi tumorale. La risposta angiogenica può anche essere live-immagine al fine di esaminare processi cellulari più dinamici. La tecnica sperimentale relativamente poco impegnativa, i costi di manutenzione a basso costo del pesce zebra e la breve linea temporale sperimentale rendono questo modello particolarmente utile per lo sviluppo di strategie per manipolare l'angiogenesi tumorale.

Esaminando un singolo xenotrapianto a 6, 24 e 48 hpi, la risposta angiogenica a diversi orari può essere calcolata come mostrato nella Figura 1A-C. La più grande risposta angiogenica si osserva tra 24-48 h dopo l'impianto, con i livelli massimi di vascolarizzazione del trapianto osservati intorno ai 2 dpi (Figura 1A-C). Un filmato time-lapse di una tipica risposta angiogenica a un B16-F1 xenotr...

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In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Lo scopo di questo metodo è quello di generare un modello in vivo di angiogenesi tumorale xenotrapianto di cellule tumorali dei mammiferi in un embrione di pesce zebra che ha vasi sanguigni etichettati fluorescentmente. Esaminando lo xenotrapianto e i vasi associati, è possibile ottenere una misurazione quantitativa della risposta angiogenica.

Imaging in vivo e quantitazione dell'ospite risposta angiogenica in Xenogrfts tumore zebrati

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Questo protocollo descrive come le larve transgeniche di zebrafish possono essere utilizzate per fornire un saggio quantitativo in vivo della vascolarizzazione dello xenografto tumorale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche precedenti è che consente allo sperimentatore di quantificare accuratamente i cambiamenti nei livelli di vascolarizzazione dello xenografto. Il passo chiave è garantire che le cellule tumorali vengano iniettate correttamente nelle larve di zebrafish in modo che le successive fasi di imaging e quantificazione non siano compromesse.Dopo aver cresciuto ed etichettato le cellule B16-F1 con colorante fluorescente, inizia a preparare embrioni per l'impianto. Riempire un piatto da 35 millimetri con una soluzione al 2% di metilcellulosa in E3 a un quarto del volume del piatto. Utilizzando una pipetta di trasferimento, posizionare circa 50 embrioni transgenici precedentemente preparati sulla metilcellulosa riducendo al minimo il volume della soluzione E3 trasferita.Usando una punta di pipetta microcapillare, disporre gli embrioni in modo che siano tutti orientati verticalmente con la testa verso l'alto, la coda verso il basso e l'embrione con il lato sinistro verso l'alto. Aggiungere il 50%ECM a un pellet di cellule B16-F1 preparato in precedenza per produrre una miscela di celle a ECM in un rapporto due a uno. Mescolare bene pipettando e mescolando e conservare la miscela sul ghiaccio.Utilizzare una pipetta microcapillare per assumere da tre a 10 microlitri di cellule. Inserire con cura la punta della pipetta in un ago di microiniezione precedentemente preparato, quindi espellere la miscela di matrice B16-F1 all'estremità dell'ago. Inserire l'ago nel supporto dell'ago e inclinarlo con un angolo di 45 gradi sul piatto.Utilizzare una pinzetta per rompere la punta dell'ago per creare un foro abbastanza grande da far espulse le cellule dall'ago senza spremere le cellule. Accendere il cilindro dell'aria pressurizzata collegato all'apparato di iniezione, quindi ruotare momentaneamente l'iniettore in modalità continua per non più di un secondo per spingere le cellule sulla punta dell'ago. Puntare l'ago verso il sacco tuorlo di un embrione e spingerlo attraverso il sacco vitellino in direzione ventrale fino a quando la punta dell'ago non è emersa dal sacco del tuorlo e sta spingendo l'epidermide embrionale sul lato ventrale dell'embrione, appena posteriore al cuore.Spingere con attenzione e leggermente la punta dell'ago in avanti fino a creare un piccolo spazio tra l'epidermide e la membrana sac del tuorlo. Pulsare l'iniettore per espellere parte della miscela cellulare in questo spazio perivitellino. Esaminare attentamente le dimensioni, la forma e la posizione dello xenoinnesto durante l'impianto e regolare il numero di impulsi e la posizione dell'ago di conseguenza per garantire uno xenoinnesto impiantato correttamente.Ripetere gli impulsi fino a quando 500-800 cellule sono state iniettate nello spazio perivitellino, creando un rigonfiamento visibile che si estende almeno la metà della strada lungo il fondo del sacco del tuorlo. Rimuovere l'ago dall'embrione. Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, utilizzare una punta di pipetta microcapillare per spingere tutti gli embrioni insieme in modo che possano essere pipettati con il meno metilcellulosa possibile.Trasferire gli embrioni in un piatto di recupero contenente E3 con PTU e blu di metilene. Quindi pipettare delicatamente E3 intorno agli embrioni per lavarli, quindi incubare a 34 gradi Celsius. Quindi immagini embrioni anestetizzati usando un microscopio confocale.Utilizzare un canale laser appropriato per le cellule tumorali per determinare un volume da imaged, consentendo almeno una o due sezioni ottiche su entrambi i lati dell'innesto. Utilizzare intervalli di sezione distanti circa cinque micrometri per creare una pila Z. Usa l'imaging a due canali per immaginare sia i vasi sanguigni che lo xenograft tumorale.Immagine dello xenograft tumorale e dei vasi sanguigni per una larva e ripetere questi passaggi per ogni larva da imageare. Per iniziare con la quantificazione della risposta angiogenica allo xenograft zebrafish, trasferire i file di immagine confocali Z stack precedentemente creati di uno xenograft tumorale in una nuova cartella sul software di analisi delle immagini 3D. Per creare il protocollo Tumor Volume per la misurazione del volume dello xenograft tumorale, passare alla scheda Misurazione del menu superiore della finestra, quindi dall'elenco dei protocolli che appare trascinare il protocollo denominato Trova oggetti nello spazio intitolato Trascina attività qui per effettuare misurazioni.Dopo aver assicurato che questo protocollo sia impostato per misurare gli oggetti nel canale tumorale, trascinare i protocolli denominati Clip to ROI e Make ROI From Population dall'elenco dei protocolli allo spazio Trascina attività qui per effettuare misurazioni, assicurandosi che questi due comandi si applichino agli oggetti identificati da Trova oggetti. Prima di calibrare le impostazioni di questo protocollo, passare al menu a discesa sopra l'etichetta Modalità in alto a sinistra della finestra e selezionare la visualizzazione Messa a fuoco estesa. Deselezionare i canali non tumorali nel riquadro all'estrema destra facendo clic sul cerchio nero sotto ogni canale in modo che sia possibile visualizzare solo il canale tumorale.Quindi usa lo strumento Mano libera nella parte superiore della finestra per disegnare una regione di interesse, o ROI, intorno a tutto il volume tumorale. Nel pannello sotto l'immagine, selezionate l'etichetta Riepilogo e quindi impostate l'opzione Visualizza per visualizzare la popolazione due. Per calibrare, nell'attività Trova oggetti fare clic sull'asterisco per aprire la finestra delle impostazioni.Regolare la soglia utilizzando l'intensità e determinare la soglia inferiore fino a quando non vengono selezionate solo le cellule tumorali e non la fluorescenza di fondo. Determinare la dimensione minima dell'oggetto in modo che solo le celle intatte siano misurate, al contrario di elementi più piccoli di detriti cellulari, impostando la dimensione minima dell'oggetto come 100 micrometri cubi. Salvare questo protocollo come volume tumorale facendo clic sulla scheda Misure del menu in alto e scegliendo Salva protocollo.Utilizzare le stesse impostazioni per misurare tutti gli xenoinnesti. Per misurare il volume dei vasi sanguigni associati allo xenograft, creare un nuovo protocollo andando al menu in alto e quindi facendo clic sulla scheda Misure e quindi su Cancella protocollo. Trascinare le attività Trova oggetti e Clip in ROM nello spazio intitolato Trascina attività qui per effettuare misurazioni per questo protocollo.Assicurarsi che il primo comando sia impostato per misurare gli oggetti nel canale del vaso sanguigno e che il comando seguente sia impostato per l'applicazione agli oggetti identificati dal primo comando. Quindi deselezionare i canali non vasi nel riquadro di estrema destra in modo che solo i vasi sanguigni possano essere visti. Determinare le impostazioni per il protocollo Vessel Volume in modo simile a quello del protocollo Tumor Volume descritto in precedenza e salvare questo protocollo come Vessel Volume.Cancella il protocollo e disegna un ROI intorno allo xenograft, facendo attenzione a non includere alcuna autofluorescenza non tumorale. Per misurare la somma del volume degli oggetti nel canale tumorale all'interno di questo ROI, fare clic sulla scheda Misure, selezionare il comando Ripristina protocollo, scegliere il protocollo Volume tumorale e fare clic su Ripristina. Utilizzando il nuovo ROI prodotto dal protocollo Tumor Volume, fare clic sulla scheda Misure e selezionare il comando Ripristina protocollo, scegliere il protocollo Vessel Volume e fare clic sulla riga di somma per calcolare il volume totale di oggetti nel canale del contenitore all'interno di questo ROI.Dividere il volume del vaso per il volume tumorale e moltiplicare la risposta per 100 per ottenere un valore percentuale di vascolarizzazione dell'innesto. Imaging di un singolo xenograft a sei, 24 e 48 ore dopo l'impianto, è possibile calcolare la risposta angiogenica in diversi punti di tempo, con la più grande risposta angiogenica tra le 24 e le 48 ore successive all'impianto e i livelli massimi di vascolarizzazione dell'innesto visti intorno alle 48 ore. L'imaging confocale time-lapse di uno xenoinnesto B16-F1 impiantato in un embrione zebrafish post-fecondazione di due giorni mostra vasi sanguigni etichettati GFP che crescono attraverso lo xenografto, formando una rete di torsione con vasi di dimensioni irregolari e morfologia tipici della rete vascolare anomala osservata nei tumori dei mammiferi.Gli xenoinnesti incubati nell'inibitore del VEGFR mostrano una grande riduzione dei vasi rispetto agli xenoinnesti di controllo incubati in DMSO. Negli embrioni di controllo, c'era una vasta rete vascolare che si estendeva su tutta la regione dello xenografto, la tipica risposta angiogenica osservata dopo l'impianto di cellule B16-F1. Se quantificata, la risposta angiogenica mostra una chiara riduzione della vascolarizzazione dell'innesto negli xenoinnesti trattati con inibitore VEGFR rispetto ai controlli.Il canale tumorale mostra una massa di cellule B16-F1 etichettate fluorescentmente sotto il sacco del tuorlo, che mostra autofluorescenza. Pertanto, un ROI deve essere accuratamente disegnato intorno allo xenograft, facendo attenzione a non includere alcuna autofluorescenza dal sacco tuorlo. Il protocollo Tumor Volume ha identificato tutte le cellule B16-F1 nel ROI, ha misurato il loro volume e ha tagliato il ROI al loro volume.Tumor Vessel Volume Protocol in questo nuovo ROI ritagliato ha permesso l'identificazione di tutti i vasi associati alla massa delle cellule B16-F1 e ha misurato il loro volume. I valori dei protocolli Volume tumorale e Volume vaso tumorale possono essere utilizzati per dare una misura della vascolarizzazione dell'innesto. La trattabilità genetica e la permeabilità del pesce zebra consentono di investigare le vie di segnalazione elevate nell'angiogenesi tumorale e possono anche fungere da piattaforma di screening per identificare composti anti-angiogenici.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

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Ricerca

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