Name: in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts
Uploaded: 2019-08-14T14:00:00
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オークランド大学ゼブラフィッシュ施設とオークランド大学医学部生物医学イメージング研究ユニットを管理してくださったアルハド・マハガオンカー氏に感謝します。この研究は、ニュージーランドプロジェクト助成金の健康研究評議会(14/105)、ニュージーランド王立協会マースデン基金プロジェクト助成金(UOA1602)、オークランド医学研究財団プロジェクト助成金(1116012)によって支援されました。

1. マイクロインジェクション針の調製
<ol><li>マイクロピペットプーラーをオンにし、次のパラメータを設定します(材料の表に記載されているマイクロピペットプーラーモデルのために校正):熱、680;プル, 75;速度, 40;時間, 55;圧力: 530.</li>
	<li>マイクロピペットプーラーにホウケイ酸塩ガラスキャピラリーを固定し、毛細血管を引っ張って2本の針を作ります。必要な数の針に対し?...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sunitinib+acts+primarily+on+tumor+endothelium+rather+than+tumor+cells+to+inhibit+the+growth+of+renal+cell+carcinoma.">Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).</li><li>Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+tumor+xenografts+induce+neovascularization+in+zebrafish+embryos.">Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos.</a> Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish.">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegfd+can+compensate+for+loss+of+Vegfc+in+zebrafish+facial+lymphatic+sprouting.">Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting.</a> Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).</li><li>Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barbigerone+inhibits+tumor+angiogenesis,+growth+and+metastasis+in+melanoma.">Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKLB1002,+a+novel+potent+inhibitor+of+VEGF+receptor+2+signaling,+inhibits+angiogenesis+and+tumor+growth+in+vivo.">SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).</li><li>Muthukumarasamy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noreremophilane-based+inhibitors+of+angiogenesis+using+zebrafish+assays.">Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).</li><li>Britto, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+enhance+Vegfa-driven+angiogenesis+in+an+embryonic+zebrafish+tumor+xenograft+model.">Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (12), (2018).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NXT2+is+required+for+embryonic+heart+development+in+zebrafish.">NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Eng, T. C. Y., Astin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Zebrafish+Facial+Lymphatics.">Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics.</a> Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors.">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768 (2011).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRN951,+a+highly+potent+inhibitor+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+tyrosine+kinases,+has+antitumor+activities+and+affects+functional+vascular+properties.">KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties.</a> Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+inflammatory+lymphangiogenesis.">A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis.</a> Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).</li><li>Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+architecture+of+human+xenotransplanted+tumors:+histological,+morphometrical,+and+ultrastructural+studies.">The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).</li><li>Vermeulen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+quantification+in+primary+colorectal+carcinoma:+an+immunohistochemical+study.">Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study.</a> British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).</li><li>Heilmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+System+for+Studying+Metastasis+Using+Transparent+Zebrafish.">A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish.</a> Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).</li><li>Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Zebrafish+to+Identify+Anti-(Lymph)Angiogenic+Compounds+for+Cancer+Treatment:+Promise+and+Future+Challenges.">Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges.</a> Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cords+Promote+Tumor+Initial+Growth+prior+to+Vascular+Function+through+a+Paracrine+Mechanism.">Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism.</a> Scientific Reports. 6, 19404 (2016).</li><li>Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+normalization+as+a+therapeutic+strategy+for+malignant+and+nonmalignant+disease.">Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).</li><li>Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+vascular+networks+in+zebrafish:+an+introduction+to+microangiography.">Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography.</a> Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).</li></ol>

プロトコルの最初の重要なステップは、腫瘍細胞の移植です。細胞を胚を脳に付着させることなく、異種移植片が胚に正常に移植できる場所に注入することが不可欠である。あまりにも前の注射は、細胞が心臓に向かって移動することを可能にし、血流を遮断し、子宮内腫につながる一方で、後部である注射は、不十分な移植異種移植片をもたらす。前部注射は、注入時に心臓から離れるよ?...

血管新生は、癌の古典的な特徴の一つであり、抗癌治療1、2の標的を表す。このプロセスを研究するために、癌の異種移植片モデルは、マウス3などの動物に哺乳類腫瘍細胞を移植することによって作成された。ゼブラフィッシュ異種移植片モデルも開発されており、これは、ゼブラフィッシュ血管の異種移植片4への急速な成長をもたらす2日後受精(dpi)ゼブラフィッシュに腫瘍細胞を移植することを含む。
このプロトコルは、血管新生応答が異種移植片全体にわたって正確に定量することができる生体内ゼブラフィッシュ胚異種移植片モデルについて説明する。この方法により、研究者は、腫瘍血管新生応答を支える分子機構を生体内で調べることができます。ゼブラフィッシュの遺伝的管分性は、宿主の寄与を尋問することを可能にするが、異なる腫瘍細胞株の選択は血管新生に対する腫瘍寄与も5、6、7を調べることができる。さらに、ゼブラフィッシュ幼虫が小分子に透過性であるとして、特異的経路阻害剤を用いることができるか、または薬物ライブラリーをスクリーニングして腫瘍血管新生8、9、10、腫瘍血管新生の新規阻害剤を同定することができる。 11.
ゼブラフィッシュ胚異種移植片モデルは、他の哺乳類異種移植片モデルと比較してユニークな利点を提示します。ゼブラフィッシュ異種移植片は、より安価で実行しやすく、多数の動物を検査することができ、生細胞イメージングは、細胞行動の詳細な検査を可能にする4。顕著な血管の成長を観察するために数週間を必要とする他の生体内モデルとは異なり、ゼブラフィッシュ異種移植片の血管新生は、移植3、4の後24時間以内に観察することができる。しかしながら、胚性ゼブラフィッシュにおける適応免疫系の欠如は、異種移植片を維持するのに有益である一方で、適応免疫応答および腫瘍血管新生に対するその寄与を調べることができないことを意味する。加えて、腫瘍間質細胞の欠如、腫瘍を矯東的に移植できないこと、およびゼブラフィッシュと哺乳動物細胞間の維持温度の差がこの方法の潜在的な弱点である。それにもかかわらず、ライブイメージングのためのこのモデルのアメニティと血管新生応答を正確に定量する能力は、生体内で腫瘍血管新生を調節する細胞プロセスを研究するために独特に有益になります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>011G</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillaries</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100T-4</td>
			<td>OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -35 mm diameter</td>
			<td>Thermofisher NZ</td>
			<td>NUN153066</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -100 mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167-500EA</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>In Vitro Technologies</td>
			<td>COR430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 &#956;M in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Drug treatment, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 
			 
			1.6 g KCl 
			 
			5.8 g CaCl2&#183;2H2O 
			 
			9.78 g MgCl2&#183;6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH</td>
			<td>In house [1]</td>
			<td></td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Xenotransplantation, Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1491</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1489</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 10 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1487</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Preparation of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (NZ origin)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10091148</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer</td>
			<td>HawksleyVet</td>
			<td>AC1000</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75004500</td>
			<td>Cell culture, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 &#956;g/ml in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point, UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methycellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9004 67 5</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader 0.5-20 &#956;L pipette tip for loading microcapillaries</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller P 87</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3516</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Media (MEM) - alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>12561056</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narishige micromanipulator</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 pipet filler</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>9501</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4485</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 2 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4486</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Needle 22 gauge</td>
			<td>Amtech</td>
			<td>SH 182</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>HeraCell 150i</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tivozanib (AV951)</td>
			<td>AVEO Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Drug treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3 mL</td>
			<td>Mediray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.25% )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Software (v6.3)</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts

腫瘍血管新生は抗癌治療の主要な標的であり、この方法は、生体内でこのプロセスを研究するための新しいモデルを提供するために開発されました。ゼブラフィッシュ異種移植片は、哺乳類の腫瘍細胞を2日後受精後ゼブラフィッシュ胚の周食空間に移植し、続いて実験エンドポイントで観察された血管新生応答の程度を2日まで測定することによって作成される。移植後。この方法の主な利点は、ジッタフィッシュ宿主血管新生応答を移植片に正確に定量する能力である。これにより、血管新生応答に対する宿主対腫瘍の寄与と同様に、分子機構の詳細な検査が可能になります。異種移植胚は、腫瘍血管新生を阻害する戦略を調べるために、潜在的な抗血管新生薬によるインキュベーションなどの様々な治療を受けることができる。血管新生応答はまた、より動的な細胞プロセスを調べるために生画像化することができる。比較的要求の厳しい実験技術、ゼブラフィッシュの安価なメンテナンスコスト、短い実験タイムラインにより、このモデルは腫瘍血管新生を操作する戦略の開発に特に役立ちます。

6、24および48 hpiで個々の異種移植片をイメージングすることにより、異なる時点での血管新生応答を図1A-Cに示すように計算することができる。最大の血管新生応答は、24〜48時間の移植後の間に観察され、移植片血管の最大レベルは2 dpiの周りに見られる(図1A-C)。補足ムービー1で見られる20.75馬力?...

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In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

この方法の目的は、哺乳類腫瘍細胞を蛍光標識血管を有するゼブラフィッシュ胚に異種移植することにより、腫瘍血管新生の生体内モデルを生成することである。異種移植片および関連する血管をイメージングすることにより、血管新生応答の定量的測定が得られる。

ゼブラフィッシュ腫瘍異種移植片における宿主血管新生応答の生体内イメージングと定量

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

このプロトコルは、トランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫を使用して、腫瘍異種移植片血管化のインビボ定量アッセイを提供する方法を記述する。これまでの技術に比べてこの技術の主な利点は、研究者が異種移植片血管化のレベルの変化を正確に定量できることです。重要なステップは、腫瘍細胞がゼブラフィッシュの幼虫に正しく注入され、その後のイメージングと定量ステップが損なわれないようにすることです。B16-F1細胞を蛍光色素で増殖し標識した後、移植のための胚の準備を開始します。35ミリメートルの皿にE3溶液の2%メチルセルロースを皿の体積の4分の1に満たします。移管ピペットを使用して、約50個の前に調製したトランスジェニック胚をメチルセルロースに配置し、転写されたE3溶液の体積を最小限に抑えます。マイクロキャピレットチップを使用して、胚が頭を上に向け、尾を底に、胚を左側に上にして垂直に向くように配置します。50%ECMを前に調製したB16-F1細胞ペレットに加え、2対1の比率でECMに細胞の混合物を生成する。ピペットと攪拌でよく混ぜ、氷の上に保存します。マイクロキャピラリーピペットを使用して、最大3〜10マイクロリットルの細胞を取ります。事前に準備したマイクロインジェクションニードルにピペットチップを慎重に挿入し、B16-F1マトリックス混合物を針の端に排出します。針ホルダーに針を挿入し、皿に45度の角度で傾けます。ピンセットを使用して針の先端を壊し、細胞を絞らずに針から排出するのに十分な大きさの穴を作ります。注入装置に取り付けられた加圧エアシリンダーをオンにし、一時的に連続モードでインジェクターを1秒以下にして、細胞を針の先端に押し込みます。卵子を胚の黄身嚢に向け、卵黄嚢の先端が黄身嚢から出てきて胚側の胚表皮を心臓に押し込むまで、葉嚢嚢を腹側方向に押し込む。慎重に、わずかにそれが表皮と黄身嚢膜の間に小さなスペースを作成するまで、針の先端を前方に押し出します。インジェクターをパルスして、細胞混合物の一部をこのペリビテリン空間に排出します。異種移植片の大きさ、形状、位置を注意深く見て、正しく移植された異種移植片を確保するために針のパルス数と位置を調整します。500〜800細胞がペリビテリン空間に注入されるまでパルスを繰り返し、黄身嚢の底に沿って少なくとも半分の道を伸ばす目に見える膨らみを作り出す。胚から針を取り出します。すべての胚を注入した後、マイクロキャピラリーピペットチップを使用してすべての胚を押し合い、できるだけ少ないメチルセルロースで配管することができます。PTUおよびメチレンブルーを有するE3を含む回復皿に胚を移す。その後、胚の周りに静かにピペットE3を洗浄し、摂氏34度でインキュベートします。次に、共焦点顕微鏡を用いて画像麻酔胚を用いた。腫瘍細胞に適したレーザーチャネルを使用して、画像化する体積を決定し、移植片の両側の少なくとも1つまたは2つの光学セクションを可能にする。Z スタックを作成するには、約 5 マイクロメートル離れた断面間隔を使用します。2チャネルイメージングを使用して、血管と腫瘍異種移植片の両方を画像化します。腫瘍異種移植片と血管を1つの幼虫に画像化し、画像化する各幼虫についてこれらのステップを繰り返す。ゼブラフィッシュ異種移植片に対する血管新生応答の定量化から始めて、腫瘍異種移植片のZスタック共焦点画像ファイルを3D画像解析ソフトウェア上の新しいフォルダに転送する。腫瘍異種移植片の体積を測定するための腫瘍体積プロトコルを作成するには、ウィンドウの上部メニューの[測定]タブに移動し、表示されるプロトコルのリストから「オブジェクトを探す」というプロトコルを「ドラッグタスクを測定する」というタイトルのスペースにドラッグします。このプロトコルが腫瘍チャネル内のオブジェクトを測定するように設定されたら、プロトコルのリストから「クリップからROIへ」と「作成からROIを作成」というプロトコルをドラッグして「ドラッグタスクを計測する」スペースにドラッグし、これら2つのコマンドが「オブジェクトの検索」で識別されるオブジェクトに適用されるようにします。このプロトコルの設定を調整する前に、ウィンドウの左上にあるモードラベルの上にあるドロップダウンメニューに移動し、拡張フォーカスビューを選択します。右端のペインの非腫瘍チャネルの選択を解除するには、各チャンネル見出しの下にある黒い円をクリックして腫瘍チャンネルのみを表示します。次に、ウィンドウの上部にあるフリーハンドツールを使用して、すべての腫瘍体積の周囲に関心のある領域(ROI)を描画します。イメージの下のパネルで[概要]ラベルを選択し、[表示]オプションを設定して、人口 2 を表示します。調整するには、[オブジェクトの検索] タスクでアスタリスクをクリックして設定ウィンドウを開きます。強度を使用してしきい値を調整し、バックグラウンド蛍光ではなく腫瘍細胞のみが選択されるまで下限閾値を決定します。最小オブジェクト サイズを 100 立方マイクロメートルに設定して、セルデブリの小さな項目とは対照的に、無傷のセルだけが測定されるように最小のオブジェクト サイズを決定します。上部メニューの[測定値]タブをクリックし、[プロトコルの保存]をクリックして、このプロトコルを腫瘍ボリュームとして保存します。すべての異種移植片を測定する場合は、同じ設定を使用します。異種移植片に関連する血管の体積を測定するには、トップメニューに移動し、[測定]タブをクリックして[クリアプロトコル]をクリックして、新しいプロトコルを作成します。「オブジェクトを検索」タスクと「ROI にクリップ」タスクを「ここにタスクをドラッグしてこのプロトコルの測定を行う」というタイトルのスペースにドラッグします。最初のコマンドが血管チャネル内のオブジェクトを測定するように設定され、最初のコマンドで識別されるオブジェクトに適用されるように次のコマンドが設定されていることを確認します。その後、血管のみを見ることができるように、極右のペインで非血管チャネルの選択を解除します。前述の腫瘍容積プロトコルと同様の方法で血管容積プロトコルの設定を決定し、このプロトコルを容器容積として保存します。プロトコルをクリアし、異種移植片の周りにROIを描き、非腫瘍自家蛍光を含めないように注意してください。この ROI 内の腫瘍チャネル内のオブジェクトの体積の合計を測定するには、[測定値] タブをクリックし、[プロトコルの復元] コマンドを選択して、[腫瘍ボリューム] プロトコルを選択して、[復元] をクリックします。腫瘍体積プロトコルによって作成された新しい ROI を使用して、「測定」タブをクリックし、「復元プロトコル」コマンドを選択し、「船舶ボリューム」プロトコルを選択して、合計行をクリックして、このROI内の容器チャネル内のオブジェクトの総体積を計算します。血管容積を腫瘍体積で割り、その答えを100で乗算して、移植片血管化のパーセンテージ値を得る。移植後6時間、24時間、48時間で個々の異種移植片をイメージングすることにより、異なる時点での血管新生応答を計算することができ、移植後24〜48時間の間の最大血管形成応答と約48時間の移植片血管化の最大レベルを有する。受精後2日間のゼブラフィッシュ胚に移植されたB16-F1異種移植片の共焦点的タイムラプスイメージングは、異種移植片を通じて成長するGFP標識血管を示し、哺乳類腫瘍に見られる異常な血管ネットワークの典型的な不規則な大きさおよび形態の血管を有するねじれネットワークを形成する。VEGFR阻害剤でインキュベートされた異種移植片は、DMSOでインキュベートされた異種移植片の対照と比較して、大きな血管減少を示す。対照胚では、異種移植片領域全体にわたって伸びる広大な血管ネットワークがあり、典型的な血管形成応答はB16-F1細胞の移植後に観察された。定量化した場合、血管形成応答は、コントロールと比較した場合にVEGFR阻害剤処理異種移植片における移植片血管化の明確な減少を示す。腫瘍チャネルは、自己蛍光を示す黄身嚢の下に蛍光標識されたB16-F1細胞の塊を示す。したがって、ROIは、卵黄嚢からの自己蛍光を含めないように注意して、異種移植片の周りに慎重に描かれなければならない。腫瘍体積プロトコルは、ROI内のすべてのB16-F1細胞を同定し、その体積を測定し、ROIをその体積に切り取った。この新しいクリップされたROIの腫瘍容器容積議定書はB16-F1細胞の質量に関連付けられているすべての容器の識別を可能にし、それらの容積を測定した。腫瘍容積および腫瘍血管容積議定書からの値は、移植片の血管化の尺度を与えるために使用することができる。ゼブラフィッシュの遺伝的な難解性と透過性は、腫瘍血管新生における高いシグナル伝達経路の調査を可能にし、抗血管新生化合物を同定するためのスクリーニングプラットフォームとしても機能することができる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

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ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

がん研究

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

放射性核種蛍光レポーターの遺伝子齧歯動物腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡するイメージング

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Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

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膠芽腫の異種移植片の生体内イメージング用蛍光分子トモグラフィー

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

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The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング

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The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

浸透マイクロ流体プラットフォームにおける患者由来異種移植片のEx vivo 3Dヒドロゲル培養の生存率の向上

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Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...