Name: in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts
Uploaded: 2019-08-14T14:00:00
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우리는 오클랜드 제브라피시 대학과 오클랜드 대학 의학 과학 대학, 의학 대학, 시간 경과 공초점 현미경 검사법에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 뉴질랜드 프로젝트 보조금의 건강 연구 위원회 (14/105), 뉴질랜드 마스덴 기금 프로젝트 보조금의 왕립 학회 (UOA1602) 및 오클랜드 의학 연구 재단 프로젝트 보조금 (1116012) J.W.A에 수여에 의해 지원되었다.

1. 미세 주사 바늘의 준비
<ol><li>마이크로파이펫 풀러를 켜고 다음 파라미터(재료 표에 나열된 마이크로파이펫 풀러 모델에 대해 보정됨): 열, 680; 당기기, 75; 속도, 40; 시간, 55; 압력: 530.</li>
	<li>보로실리케이트 유리 모세관을 마이크로파이펫 풀러에 고정하고 모세관을 당겨 두 개의 바늘을 만듭니다. 원하는 만큼 바늘을 반복하십시오.</li>
</ol>2. 이식용 세포 배양
...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sunitinib+acts+primarily+on+tumor+endothelium+rather+than+tumor+cells+to+inhibit+the+growth+of+renal+cell+carcinoma.">Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).</li><li>Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+tumor+xenografts+induce+neovascularization+in+zebrafish+embryos.">Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos.</a> Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish.">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegfd+can+compensate+for+loss+of+Vegfc+in+zebrafish+facial+lymphatic+sprouting.">Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting.</a> Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).</li><li>Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barbigerone+inhibits+tumor+angiogenesis,+growth+and+metastasis+in+melanoma.">Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKLB1002,+a+novel+potent+inhibitor+of+VEGF+receptor+2+signaling,+inhibits+angiogenesis+and+tumor+growth+in+vivo.">SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).</li><li>Muthukumarasamy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noreremophilane-based+inhibitors+of+angiogenesis+using+zebrafish+assays.">Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).</li><li>Britto, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+enhance+Vegfa-driven+angiogenesis+in+an+embryonic+zebrafish+tumor+xenograft+model.">Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (12), (2018).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NXT2+is+required+for+embryonic+heart+development+in+zebrafish.">NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Eng, T. C. Y., Astin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Zebrafish+Facial+Lymphatics.">Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics.</a> Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors.">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768 (2011).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRN951,+a+highly+potent+inhibitor+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+tyrosine+kinases,+has+antitumor+activities+and+affects+functional+vascular+properties.">KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties.</a> Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+inflammatory+lymphangiogenesis.">A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis.</a> Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).</li><li>Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+architecture+of+human+xenotransplanted+tumors:+histological,+morphometrical,+and+ultrastructural+studies.">The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).</li><li>Vermeulen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+quantification+in+primary+colorectal+carcinoma:+an+immunohistochemical+study.">Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study.</a> British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).</li><li>Heilmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+System+for+Studying+Metastasis+Using+Transparent+Zebrafish.">A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish.</a> Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).</li><li>Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Zebrafish+to+Identify+Anti-(Lymph)Angiogenic+Compounds+for+Cancer+Treatment:+Promise+and+Future+Challenges.">Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges.</a> Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cords+Promote+Tumor+Initial+Growth+prior+to+Vascular+Function+through+a+Paracrine+Mechanism.">Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism.</a> Scientific Reports. 6, 19404 (2016).</li><li>Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+normalization+as+a+therapeutic+strategy+for+malignant+and+nonmalignant+disease.">Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).</li><li>Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+vascular+networks+in+zebrafish:+an+introduction+to+microangiography.">Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography.</a> Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).</li></ol>

프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 종양 세포의 이식입니다. 세포가 배아 부종을 만들지 않고 배아에 성공적으로 이식 할 수있는 위치에 세포를 주입하는 것이 필수적입니다. 너무 앞쪽인 주사는 세포가 심장쪽으로 움직이도록 허용하여 혈류를 차단하고 부종으로 이어질 수 있으며, 너무 후방인 주사는 이식이 제대로 되지 않습니다. 전방 주사는 주입으로 심혼에서 멀리 가리키도록 후방 방향으?...

혈관신생은 암의 고전적인 특징 중 하나이며 항암 치료1,2의표적을 나타낸다. 이 과정을 연구하기 위해, 암의 이종이식 모델은 마우스3과같은 동물에 포유류 종양 세포를 이식함으로써 생성되었다. 제브라피시 이종이식 모델도 개발되어 종양 세포를 2일 후 수정(dpi) 제브라피쉬로 이식하여 제브라피시 혈관이 이종이식으로급속히 성장하게 된다4.
이 프로토콜은 혈관신생 반응이 전체 이종이식에 걸쳐 정확하게 정량화될 수 있는 생체 내 제브라피쉬 배아 종양 이종이식 모델을 기술한다. 이 방법은 조사자가 종양 혈관신생 반응을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 생체 내에서 검사할 수 있게 한다. 제브라피시의 유전성성은 숙주 기여도를 심문할 수 있게 하고, 다른 종양 세포주를 선택하면 혈관신생에대한 종양 기여도도 5,6,7을검사할 수 있다. 또한, 제브라피쉬 유충이 소분자에 투과성됨에 따라, 특정 경로 억제제가 사용될 수 있거나 약물 라이브러리를 스크리브하여종양 혈관신생의 신규 억제제를 식별할 수 있다 8,9,10, 11.
제브라피쉬 배아 이종이식 모델은 다른 포유류 이종이식 모델과 비교하여 고유한 이점을 제공합니다. Zebrafish 이종이식은 저렴하고 수행하기 쉬우며, 많은 수의 동물을 검사할 수 있으며 살아있는 세포 이미징을 통해 세포 행동을 자세히 검사 할 수있습니다4. 유의한 혈관 성장을 관찰하기 위해 최대 몇 주가 필요한 생체 내 모델과 달리, 제브라피시 이종이식에서혈관신생은 이식 후 24시간 이내에 관찰될 수 있다3,4. 그러나, 배아 제브라피시에 적응성 면역 계통의 부족은, 이종이식을 유지하는 데 유익하면서, 적응성 면역 반응 및 종양 혈관신생을 향한 그것의 기여가 검토될 수 없다는 것을 의미한다. 또한, 종양 기질 세포의 부족, 종양을 직교적으로 이식할 수 없는 무능력 및 제브라피시와 포유류 세포 사이의 유지 보수 온도의 차이는 이 방법의 잠재적 약점이다. 그럼에도 불구하고, 살아있는 화상 진찰을 위한 이 모형의 어메니티 및 정확하게 혈관신생 반응을 양량하는 기능은 생체내에서 종양 혈관신생을 조절하는 세포 과정을 연구하는 것을 유일하게 유익하게 만듭니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>011G</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillaries</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100T-4</td>
			<td>OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -35 mm diameter</td>
			<td>Thermofisher NZ</td>
			<td>NUN153066</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -100 mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167-500EA</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>In Vitro Technologies</td>
			<td>COR430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 &#956;M in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Drug treatment, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 
			 
			1.6 g KCl 
			 
			5.8 g CaCl2&#183;2H2O 
			 
			9.78 g MgCl2&#183;6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH</td>
			<td>In house [1]</td>
			<td></td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Xenotransplantation, Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1491</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1489</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 10 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1487</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Preparation of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (NZ origin)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10091148</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer</td>
			<td>HawksleyVet</td>
			<td>AC1000</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75004500</td>
			<td>Cell culture, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 &#956;g/ml in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point, UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methycellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9004 67 5</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader 0.5-20 &#956;L pipette tip for loading microcapillaries</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller P 87</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3516</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Media (MEM) - alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>12561056</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narishige micromanipulator</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 pipet filler</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>9501</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4485</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 2 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4486</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Needle 22 gauge</td>
			<td>Amtech</td>
			<td>SH 182</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>HeraCell 150i</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tivozanib (AV951)</td>
			<td>AVEO Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Drug treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3 mL</td>
			<td>Mediray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.25% )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Software (v6.3)</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts

종양 혈관신생은 항암 치료의 주요 표적이며 이 방법은 생체 내에서 이 과정을 연구하는 새로운 모델을 제공하기 위해 개발되었다. 제브라피시 이종이식은 포유류 종양 세포를 2일 후 수정 후 제지피시 배아의 연막 공간에 이식한 다음, 최대 2일까지 실험 종점에서 관찰된 혈관신생 반응의 정도를 측정하여 생성됩니다. 이식 후. 이 방법의 주요 장점은 접목에 대한 제브라피쉬 숙주 혈관신생 반응을 정확하게 정량화하는 능력이다. 이것은 혈관 신생 반응에 호스트 대 종양 기여뿐만 아니라 분자 메커니즘의 상세한 검사를 가능하게합니다. 이종이식 된 배아는 종양 혈관 신생을 억제하는 전략을 조사하기 위해 잠재적 인 항 혈관 신생 약물을 사용하여 배양하는 것과 같은 다양한 치료를 받을 수 있습니다. 혈관 신생 반응은 또한 더 역동적 인 세포 과정을 검사하기 위해 라이브 이미지 화 될 수있다. 상대적으로 까다로운 실험 기술, 제브라피시의 저렴한 유지 보수 비용 및 짧은 실험 타임 라인은 종양 혈관 신생을 조작하는 전략의 개발에 특히 유용합니다.

6, 24 및 48 hpi에서 개별 이종이식을 이미징함으로써, 상이한 시점에서의 혈관신생 반응은 도 1A-C에 도시된 바와 같이 계산될 수 있다. 가장 큰 혈관 신생 반응은 이식 후 24-48 시간 사이에서 관찰되며, 접목 혈관의 최대 수준은 2 dpi (그림1A-C)에서볼 수 있습니다. B16-F1 이종이식에 대한 전형적인 혈관신생 ...

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In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

이 방법의 목적은 형광표지된 혈관이 있는 제브라피시 배아로 포유류 종양 세포를 이종이식에 이식함으로써 종양 혈관신생의 생체 내 모델을 생성하는 것이다. 이종이식 및 관련 혈관을 이미징함으로써, 혈관신생 반응의 정량적 측정을 얻을 수 있다.

제브라피시 종양 이종이식에서 숙주 혈관조형성 반응의 생체 내 이미징 및 정량화

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

이 프로토콜은 어떻게 형질 전환 제브라피시 애벌레가 종양 xenograft 혈관화의 생체 내 정량적 분석법을 제공하기 위하여 이용될 수 있는지 설명합니다. 이전 기술에 비해이 기술의 주요 장점은 조사관이 정확하게 xenograft 혈관의 수준에 있는 변경을 양수하는 것을 허용한다는 것입니다. 중요한 단계는 종양 세포가 후속 화상 진찰 및 양 단계가 손상되지 않도록 제브라피시 애벌레에 정확하게 주입되는지 확인하는 것입니다.형광염으로 B16-F1 세포를 성장하고 라벨을 붙인 후 이식을 위한 배아를 준비하기 시작합니다. 35mm 접시에 E3 용액의 2%메틸셀룰로오스를 접시의 1/4에 채웁니다. 이송 파이펫을 사용하여 이전에 준비된 약 50개의 형질 성 배아를 메틸셀룰로오스에 배치하면서 전송된 E3 용액의 양을 최소화합니다.마이크로 모세관 파이펫 팁을 사용하여 배아를 정렬하여 모두 머리위로 수직으로 향하고, 꼬리를 아래로, 왼쪽이 위로 있는 배아를 정렬합니다. 이전에 준비된 B16-F1 셀 펠릿에 50%ECM을 추가하여 2대 1 비율로 ECM에 세포의 혼합물을 생성합니다. 파이펫팅과 교반으로 잘 섞은 다음 혼합물을 얼음에 보관합니다.마이크로 카세필리 파이펫을 사용하여 세포의 3 ~10 마이크로 리터를 차지하십시오. 파이펫 팁을 이전에 준비된 미세 주입 바늘에 조심스럽게 삽입한 다음 B16-F1 매트릭스 혼합물을 바늘 끝으로 배출합니다. 바늘을 바늘 홀더에 넣고 45도 각도로 기울어 접시에 기울입니다.핀셋을 사용하여 바늘 끝을 부러뜨려 세포를 압박하지 않고 바늘에서 배출 될 수있는 세포를 충분히 크게 만듭니다. 사출 장치에 부착된 가압 공기 실린더를 켜고, 잠시 연속 모드에서 인젝터를 연속 모드로 돌려 1초 이상 바늘끝까지 세포를 밀어넣습니다. 바늘을 배아의 노른자 낭쪽으로 가리키고, 바늘의 끝이 노른자 낭에서 나타났을 때까지 복부 방향으로 노른자 주머니를 통해 밀어 내고 배아의 복부 측에 배아 표피를 밀어 넣고, 단지 후면이 심장으로 밀어 넣습니다.표피와 노른자 낭 막 사이의 작은 공간을 만들 때까지 바늘 끝을 조심스럽게 약간 밀어 넣습니다. 인젝터를 펄스하여 일부 세포 혼합물을 이 인식 공간으로 배출합니다. 이식되는 이노이식의 크기, 모양 및 위치를 주의 깊게 살펴보고, 그에 따라 바늘의 펄스 수와 위치를 조정하여 올바르게 이식된 이종이이식을 보장한다.500 내지 800 세포가 각막 공간에 주입될 때까지 펄스를 반복하여 노른자 낭의 바닥을 따라 길의 적어도 절반을 확장하는 눈에 보이는 벌지를 만듭니다. 배아에서 바늘을 제거합니다. 모든 배아를 주입 한 후, 마이크로 카세필리 파이펫 팁을 사용하여 모든 배아를 함께 밀어 서 가능한 한 적은 메틸 셀룰로오스로 피펫 처리 할 수 있습니다.배아를 PTU와 메틸렌 블루로 E3를 함유한 복구 접시로 옮깁니다. 그런 다음 배아 주위에 E3를 부드럽게 피펫하여 세척한 다음 섭씨 34도에서 배양합니다. 그런 다음 공초점 현미경을 사용하여 마취 된 배아를 이미지화합니다.종양 세포에 적합한 레이저 채널을 사용하여 이미지화되는 부피를 결정하여 접목의 어느 한쪽 에 적어도 하나 또는 두 개의 광학 섹션을 허용합니다. Z 스택을 만들기 위해 5 마이크로미터 간격을 사용합니다. 2채널 이미징을 사용하여 혈관과 종양 이종이 이식을 모두 이미지화합니다.종양 이노이식과 혈관을 하나의 애벌레에 대해 이미지화하고 각 유충을 이미지화할 각 단계를 반복합니다. 제브라피시 제노이식에 대한 혈관신생 반응의 양으로 시작하기 위해 이전에 생성된 Z 스택 공초점 이미지 파일을 3D 이미지 분석 소프트웨어의 새 폴더로 옮긴다. 종양 xenograft 볼륨을 측정하기 위한 종양 볼륨 프로토콜을 만들려면 창의 상단 메뉴의 측정 탭으로 이동한 다음 프로토콜 찾기라는 프로토콜을 드래그하여 개체 찾기라는 제목의 공간으로 드래그하여 측정을 수행합니다.이 프로토콜이 종양 채널의 개체를 측정하도록 설정된지 확인한 후 클립 이라는 프로토콜을 ROI로 드래그하고 프로토콜 목록에서 채우기에서 측정 공간을 만들기 위해 채우기에서 ROI를 만들어 개체 찾기에서 식별한 개체에 이 두 명령이 적용되는지 확인합니다. 이 프로토콜의 설정을 보정하기 전에 창 왼쪽 상단에 있는 모드 레이블 위의 드롭다운 메뉴로 이동하여 확장 포커스 보기를 선택합니다. 각 채널 제목 아래의 검은 원을 클릭하여 맨 오른쪽에 있는 창에 있는 비종양 채널을 선택 해제하여 종양 채널만 볼 수 있도록 합니다.그런 다음 창 상단의 Freehand 도구를 사용하여 모든 종양 부피 주위에 관심 영역 또는 ROI를 그립니다. 이미지 아래 패널에서 요약 레이블을 선택한 다음 표시 옵션을 설정하여 도면 2를 표시합니다. 개체 찾기 작업에서 보정하려면 별표를 클릭하여 설정 창을 엽니다.강도를 사용하여 임계값을 조정하고, 배경 형광이 아닌 종양 세포만 선택될 때까지 낮은 임계값을 결정합니다. 최소 오브젝트 크기를 최소 개체 크기를 100입방 마이크로미터로 설정하여 셀 이물질의 작은 항목과 달리 그대로 셀만 측정되도록 결정합니다. 상위 메뉴의 측정 탭을 클릭하고 프로토콜 저장을 클릭하여 이 프로토콜을 종양 볼륨으로 저장합니다.모든 제노이식을 측정하기 위해 동일한 설정을 사용합니다. xenograft 관련 혈관의 양을 측정하려면 상단 메뉴로 이동한 다음 측정 탭을 클릭한 다음 프로토콜을 지우는 새 프로토콜을 만듭니다. 개체 찾기 및 클립 을 ROI로 드래그하여 이 프로토콜에 대한 측정을 수행하려면 여기에 작업 드래그작업이라는 제목의 공간으로 드래그합니다.첫 번째 명령이 혈관 채널의 객체를 측정하도록 설정되어 있는지 확인하고 다음 명령이 첫 번째 명령에 의해 식별된 개체에 적용하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 혈관만 볼 수 있도록 극우 창에 있는 비 혈관 채널을 선택 해제합니다. 이전에 설명한 종양 볼륨 프로토콜과 유사한 방식으로 선박 볼륨 프로토콜에 대한 설정을 결정하고 이 프로토콜을 용기 볼륨으로 저장합니다.프로토콜을 지우고, 어떤 비 종양 자동 형광을 포함하지 않도록주의, xenograft 주위에 ROI를 그립니다. 이 ROI 내부의 종양 채널에서 개체의 부피를 측정하려면 측정 탭을 클릭하고 프로토콜 복원 명령을 선택하고 종양 볼륨 프로토콜을 선택하고 복원을 클릭합니다. 종양 볼륨 프로토콜에 의해 만들어진 새로운 ROI를 사용하여 측정 탭을 클릭하고 복원 프로토콜 명령을 선택하고, 선박 볼륨 프로토콜을 선택하고, 합계 행을 클릭하여 이 ROI 내부의 선박 채널내의 개체의 총 볼륨을 계산합니다.혈관 부피를 종양 부피로 나누고, 해답을 100으로 곱하여 이식 혈관화의 백분율 값을 얻습니다. 6, 24 및 48 시간 이식 후 개별 이뇨 이식을 이미징함으로써, 다른 시점에서 혈관 신생 반응을 계산할 수 있으며, 이식 후 24~48시간 사이의 가장 큰 혈관 신생 반응과 48시간 경에 볼 수 있는 이식 혈관화의 최대 수준을 확인할 수 있습니다. 2일 간 이식된 B16-F1 이종이이식의 공초점 시간 경과 이미징은 Xenograft를 통해 성장하는 GFP 라벨혈관을 나타내며, 포유류 종양에서 볼 수 있는 비정상적인 혈관 네트워크의 전형적인 불규칙한 크기와 형태학적 혈관을 형성하는 꼬임 네트워크를 형성한다.VEGFR 억제제에서 배양된 제노이식은 DMSO에서 배양된 대조군 이노이식에 비해 큰 혈관 감소를 보여준다. 대조군 배아에서는 B16-F1 세포의 이식 후 관찰된 전형적인 혈관신생 반응인 전체 제노이식 부위를 가로지르는 광대한 혈관망이 있었다. 정량화되면 혈관신생 반응은 대조군과 비교할 때 VEGFR 억제제-처리된 제노이식에서 이식혈관화의 명확한 감소를 나타낸다.종양 채널은 자동 형광을 표시하는 노른자 낭 아래에 형광으로 표시된 B16-F1 세포의 질량을 보여줍니다. 따라서, ROI는 노른자 낭에서 자동 형광을 포함하지 않도록주의, xenograft 주위에 신중하게 그려져야한다. 종양 볼륨 프로토콜은 ROI내의 모든 B16-F1 세포를 식별하고, 부피를 측정하고, ROI를 그들의 부피에 클리핑하였다.이 새로운 잘린 ROI에서 종양 혈관 부피 프로토콜은 B16-F1 세포의 질량과 관련된 모든 혈관의 식별을 허용하고 그들의 부피를 측정하였다. 종양 부피 및 종양 혈관 부피 프로토콜의 값은 접목 혈관화의 척도를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 제브라피시의 유전적 기관성 및 투과성은 종양 혈관 신생에 있는 높은 신호 통로의 조사를 허용하고, 또한 항 혈관신생 화합물을 확인하기 위하여 검열 플랫폼으로 작동할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

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그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

조작된 종양 관련 호중구를 종양 베어링 마우스로 옮겨 생체 내 혈관신생 잠재력을 연구합니다.

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...