Name: in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts
Uploaded: 2019-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts at JoVE.com

Vi takker Mr. Alhad Mahagaonkar for å håndtere University of Auckland sebrafisk anlegget og Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland, for assistanse i time-lapse konfokalmikroskopi mikroskopi. Dette arbeidet ble støttet av et prosjekt stipend for helse forskningsråd på New Zealand (14/105), en Royal Society of New Zealand Marsden Fund Project Grant (UOA1602) og en Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) tildelt J.W.A.

1. utarbeidelse av Microinjection Needles
<ol><li>Slå på en micropipette-avtrekker og angi følgende parametere (kalibrert for micropipette avtrekker-modellen som er oppført i innholdsfortegnelsen): Heat, 680; Trekk, 75; Hastighet, 40; Tid, 55; Trykk: 530.</li>
	<li>Fest en Borosilikatglass glass kapillær inn i micropipette avtrekker og trekk kapillær for å lage to nåler. Gjenta for så mange nåler som ønsket.</li>
</ol>2. cellekultur for implantation
<p class="jove_c...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sunitinib+acts+primarily+on+tumor+endothelium+rather+than+tumor+cells+to+inhibit+the+growth+of+renal+cell+carcinoma.">Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).</li><li>Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+tumor+xenografts+induce+neovascularization+in+zebrafish+embryos.">Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos.</a> Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish.">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegfd+can+compensate+for+loss+of+Vegfc+in+zebrafish+facial+lymphatic+sprouting.">Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting.</a> Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).</li><li>Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barbigerone+inhibits+tumor+angiogenesis,+growth+and+metastasis+in+melanoma.">Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKLB1002,+a+novel+potent+inhibitor+of+VEGF+receptor+2+signaling,+inhibits+angiogenesis+and+tumor+growth+in+vivo.">SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).</li><li>Muthukumarasamy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noreremophilane-based+inhibitors+of+angiogenesis+using+zebrafish+assays.">Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).</li><li>Britto, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+enhance+Vegfa-driven+angiogenesis+in+an+embryonic+zebrafish+tumor+xenograft+model.">Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (12), (2018).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NXT2+is+required+for+embryonic+heart+development+in+zebrafish.">NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Eng, T. C. Y., Astin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Zebrafish+Facial+Lymphatics.">Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics.</a> Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors.">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768 (2011).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRN951,+a+highly+potent+inhibitor+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+tyrosine+kinases,+has+antitumor+activities+and+affects+functional+vascular+properties.">KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties.</a> Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+inflammatory+lymphangiogenesis.">A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis.</a> Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).</li><li>Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+architecture+of+human+xenotransplanted+tumors:+histological,+morphometrical,+and+ultrastructural+studies.">The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).</li><li>Vermeulen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+quantification+in+primary+colorectal+carcinoma:+an+immunohistochemical+study.">Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study.</a> British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).</li><li>Heilmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+System+for+Studying+Metastasis+Using+Transparent+Zebrafish.">A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish.</a> Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).</li><li>Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Zebrafish+to+Identify+Anti-(Lymph)Angiogenic+Compounds+for+Cancer+Treatment:+Promise+and+Future+Challenges.">Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges.</a> Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cords+Promote+Tumor+Initial+Growth+prior+to+Vascular+Function+through+a+Paracrine+Mechanism.">Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism.</a> Scientific Reports. 6, 19404 (2016).</li><li>Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+normalization+as+a+therapeutic+strategy+for+malignant+and+nonmalignant+disease.">Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).</li><li>Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+vascular+networks+in+zebrafish:+an+introduction+to+microangiography.">Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography.</a> Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).</li></ol>

Det første kritiske trinnet i protokollen er implantation av tumorceller. Det er viktig at cellene injiseres i et sted som vil tillate xenograft å implantatet vellykket i fosteret uten å gjøre embryo edematous. En injeksjon som er for fremre kan tillate cellene til å bevege seg mot hjertet, blokkerer blodet og fører til ødem, mens en injeksjon som er for bakre vil resultere i en dårlig implantert xenograft. En fremre injeksjon er best unngås ved å sette inn nålen gjennom eggeplomme sac i en fremre til bakre re...

Angiogenese er en av de klassiske kjennetegnene av kreft og representerer et mål for anti-kreft terapi1,2. For å studere denne prosessen, xenograft modeller av kreft har blitt skapt av implanting pattedyr tumorceller til dyr som mus3. En sebrafisk xenograft modellen har også blitt utviklet, som innebærer implantation av tumorceller i 2 dager etter befruktning (dpi) sebrafisk som resulterer i rask vekst av sebrafisk blodkar i xenograft4.
Denne protokollen beskriver en in vivo sebrafisk embryo tumor xenograft modell der angiogenic responsen kan være nøyaktig quantitated over hele xenograft. Denne metoden gjør at etterforsker å undersøke, in vivo, den molekylære mekanismer som underbygger tumor angiogenic respons. Den genetiske føyelighet til sebrafisk gjør at verts bidraget kan bli avhørt, mens valg av ulike tumor cellelinjer gjør at tumor bidraget til angiogenese også kan undersøkes5,6,7. I tillegg, som sebrafisk larver er gjennomtrengelig for små molekyler, kan spesifikk sti hemmere brukes eller medikament biblioteker kan bli vist for å identifisere romanen hemmere av tumor angiogenese8,9,10, 11i.
Den sebrafisk embryo xenograft modellen presenterer unike fordeler sammenlignet med andre pattedyr xenograft modeller. Sebrafisk xenotransplantater er billigere og enklere å utføre, kan et stort antall dyr undersøkes og live celle bildebehandling gir detaljert undersøkelse av celle atferd4. I motsetning til andre in vivo-modeller, som krever opp til flere uker for å observere betydelig fartøy vekst, kan angiogenese i sebrafisk xenotransplantater observeres innen 24 h etter implantat3,4. Men mangelen på en adaptiv immunsystem i embryonale sebrafisk, mens fordelaktig å opprettholde xenograft, betyr at adaptive immunresponsen og dens bidrag til tumor angiogenese kan ikke undersøkes. I tillegg er mangelen på tumor stromal celler, manglende evne til å orthotopically implantatet svulsten og forskjellen i vedlikeholds temperatur mellom sebrafisk og pattedyrceller er potensielle svakheter ved denne metoden. Likevel, amenability av denne modellen for Live Imaging og evnen til å nøyaktig quantitate den angiogenic responsen gjør det unikt fordelaktig for å studere cellulære prosesser som regulerer tumor angiogenese in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>011G</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillaries</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100T-4</td>
			<td>OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -35 mm diameter</td>
			<td>Thermofisher NZ</td>
			<td>NUN153066</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -100 mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167-500EA</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>In Vitro Technologies</td>
			<td>COR430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 &#956;M in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Drug treatment, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 
			 
			1.6 g KCl 
			 
			5.8 g CaCl2&#183;2H2O 
			 
			9.78 g MgCl2&#183;6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH</td>
			<td>In house [1]</td>
			<td></td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Xenotransplantation, Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1491</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1489</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 10 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1487</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Preparation of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (NZ origin)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10091148</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer</td>
			<td>HawksleyVet</td>
			<td>AC1000</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75004500</td>
			<td>Cell culture, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 &#956;g/ml in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point, UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methycellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9004 67 5</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader 0.5-20 &#956;L pipette tip for loading microcapillaries</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller P 87</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3516</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Media (MEM) - alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>12561056</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narishige micromanipulator</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 pipet filler</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>9501</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4485</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 2 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4486</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Needle 22 gauge</td>
			<td>Amtech</td>
			<td>SH 182</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>HeraCell 150i</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tivozanib (AV951)</td>
			<td>AVEO Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Drug treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3 mL</td>
			<td>Mediray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.25% )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Software (v6.3)</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts

Tumor angiogenese er et viktig mål for anti-kreft terapi og denne metoden er utviklet for å gi en ny modell for å studere denne prosessen in vivo. En sebrafisk xenograft er skapt av implanting pattedyr tumorceller inn i perivitelline plass av to dager-post-befruktning sebrafisk embryo, etterfulgt av å måle omfanget av angiogenic respons observert på et eksperimentelt endepunkt opp til to dager etter implantation. Det nøkkel fordel å denne metoden er evnen å akkurat quantitate det sebrafisk vert angiogenic svaret å det pode. Dette muliggjør detaljert undersøkelse av molekylære mekanismer samt verten vs tumor bidrag til angiogenic respons. Den xenografted embryo kan bli utsatt for en rekke behandlinger, for eksempel inkubasjons med potensielle anti-angiogenese narkotika, for å undersøke strategier for å hemme tumor angiogenese. Den angiogenic responsen kan også være levende avbildet for å undersøke mer dynamiske cellulære prosesser. Den relativt lite krevende eksperimentell teknikk, billige vedlikeholdskostnader av sebrafisk og korte eksperimentelle tidslinjen gjør denne modellen spesielt nyttig for utvikling av strategier for å manipulere tumor angiogenese.

Ved Imaging en individuell xenograft på 6, 24 og 48 HPI, kan angiogenic respons på ulike tidspunkter beregnes som vist i figur 1a-C. Den største angiogenic responsen er observert mellom 24-48 h etter implantation, med det maksimale nivået av pode endometrial blodkar sett rundt 2 dpi (figur 1a-C). En time-lapse film av en typisk angiogenic respons på en b16-F1 xenograft fra 20,75 HPI til 46 H...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts at JoVE.com

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Målet med denne metoden er å generere en in vivo modell av tumor angiogenese ved xenografting pattedyr tumorceller til et sebrafisk embryo som har fluorescensmerkete blodkar. Ved å avbilde xenograft og tilhørende fartøy, kan en kvantitativ måling av angiogenic respons oppnås.

I vivo Imaging og kvantifisering av Host angiogenic Response i sebrafisk tumor Xenotransplantater

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Denne protokollen beskriver hvordan transgene sebrafisk larver kan brukes til å gi en in vivo kvantitativ analyse av tumor xenograft vaskularisering. Den største fordelen med denne teknikken over tidligere teknikker er at det gjør det mulig for utprøver å nøyaktig kvantate endringer i nivåene av xenograft vaskularisering. Hovedtrinnet er å sikre at tumorcellene injiseres riktig i sebrafisk larver slik at etterfølgende bilde- og mengdetrinn ikke blir kompromittert.Etter å ha vokst og merket B16-F1 celler med fluorescerende fargestoff, begynne å forberede embryoer for implantasjon. Fyll en 35-millimeter tallerken med en 2% metylcellulose i E3-løsning til en fjerdedel av volumet av parabolen. Bruk en overføringspipette, plasser ca. 50 tidligere forberedte transgene embryoer på metylcellulosen samtidig som volumet av E3-oppløsningen overføres.Bruk en mikrokapillær pipettespiss, ordne embryoene slik at de alle er orientert vertikalt med hodet til toppen, haler til bunnen og embryoet med venstre side opp. Legg til 50 % ECM i en tidligere forberedt B16-F1 cellepellet for å produsere en blanding av celler til ECM i et to-til-en-forhold. Bland godt ved å pipettering og omrøring, og lagre blandingen på is.Bruk en mikrokapillær pipette til å ta opp tre til 10 mikroliter celler. Sett pipettespissen forsiktig inn i en tidligere forberedt mikroinjeksjonsnål, og løs deretter B16-F1 matriseblandingen inn i enden av nålen. Sett nålen inn i nåleholderen, og vipp i en 45-graders vinkel til parabolen.Bruk pinsett til å bryte tuppen av nålen for å gjøre et hull stort nok til at cellene kan kastes ut fra nålen uten å klemme cellene. Slå på den trykksylinderen festet til injeksjonsapparatet, og vri deretter injektoren på kontinuerlig modus i ikke mer enn ett sekund for å skyve cellene til spissen av nålen. Pek nålen mot eggeplommeseken til et embryo, og skyv den gjennom eggeplommeseken i ventral retning til spissen av nålen har kommet ut av eggeplommeseken og skyver embryonale epidermis på ventral side av embryoet, bare bakre til hjertet.Skyv forsiktig og forsiktig nålens spiss fremover til den har skapt et lite mellomrom mellom epidermis og eggeplommesemisk membran. Pulsinjektoren for å kaste ut noe av celleblandingen inn i dette perivitelline rommet. Se nøye på størrelsen, formen og plasseringen av xenograftet når den implanteres, og juster pulsnummeret og posisjonen til nålen tilsvarende for å sikre en korrekt implantert xenograft.Gjenta pulsene til 500 til 800 celler har blitt injisert i perivitelline-rommet, og skaper en synlig bule som strekker seg minst halvparten av veien langs bunnen av eggeplommeseken. Fjern nålen fra embryoet. Etter å ha injisert alle embryoene, bruk en mikrokapillær pipettespiss for å skyve alle embryoene sammen slik at de kan pipetteres ut med så lite metylcellulose som mulig.Overfør embryoene til en gjenopprettingsfat som inneholder E3 med PTU og metylenblå. Deretter pipette E3 forsiktig rundt embryoene for å vaske dem, og deretter inkubere ved 34 grader Celsius. Deretter bilde bedøvet embryoer ved hjelp av et konfokal mikroskop.Bruk en laserkanal som passer for tumorcellene til å bestemme et volum som skal avbildes, slik at minst en eller to optiske seksjoner på hver side av transplantatet. Bruk inndelingsintervaller som er rundt fem mikrometer fra hverandre for å opprette en Z-stabel. Bruk tokanals bildebehandling for å bilde både blodårene og svulsten xenograft.Bilde svulsten xenograft og blodårene for en larve, og gjenta disse trinnene for hver larve som skal avbildes. Til å begynne med kvantisering av angiogen respons på sebrafisk xenograft, overføre tidligere opprettet Z stabel confocal bildefiler av en svulst xenograft til en ny mappe på 3D bildeanalyse programvare. Hvis du vil opprette tumorvolumprotokollen for måling av tumorxenograftvolum, går du til kategorien Måling på den øverste menyen i vinduet, og deretter drar du protokollen Finn objekter til det området som heter Dra oppgaver her for å gjøre målinger.Når du har sikret at denne protokollen er satt til å måle objekter i tumorkanalen, drar du protokollene kalt Klipp til ROIer og Gjør roi fra populasjon fra listen over protokoller til Dra oppgaver her for å gjøre målinger plass, og kontrollerer at disse to kommandoene gjelder for objektene identifisert av Søk etter objekter. Før du kalibrerer innstillingene for denne protokollen, går du til rullegardinmenyen over Modus-etiketten øverst til venstre i vinduet, og velger visningen Utvidet fokus. Fjern merket for ikke-tumorkanalene i ruten helt til høyre ved å klikke den svarte sirkelen under hver kanaloverskrift, slik at bare tumorkanalen kan ses.Bruk deretter Frihåndsverktøyet øverst i vinduet for å tegne et interesseområde, eller AVKASTNING, rundt hele tumorvolumet. Velg Sammendrag-etiketten i panelet under bildet, og angi deretter Visning-alternativet for å vise populasjon to. Hvis du vil kalibrere, klikker du stjernen på søk etter objekter-oppgaven for å åpne innstillingsvinduet.Juster terskelen ved hjelp av intensitet, og bestem den nedre terskelen til bare tumorcellene er valgt og ikke bakgrunnsfluorescensen. Bestem minimumsobjektstørrelsen slik at bare intakte celler måles, i motsetning til mindre elementer av celleavfall, ved å angi minimum objektstørrelse som 100 kubikkmikrometer. Lagre denne protokollen som tumorvolum ved å klikke på Målinger-fanen på toppmenyen og klikke Lagre protokoll.Bruk de samme innstillingene for måling av alle xenografter. For å måle volumet av xenograft-tilknyttede blodkar, opprett en ny protokoll ved å gå til toppmenyen og deretter klikke på Målinger-fanen og deretter Fjern protokoll. Dra oppgavene Søk etter objekter og Klipp til ROIer inn i området som har tittelen Dra oppgaver her for å gjøre målinger for denne protokollen.Kontroller at den første kommandoen er satt til å måle objekter i blodkarkanalen, og at følgende kommando er satt til å gjelde for objektene som er identifisert av den første kommandoen. Fjern deretter merket for ikke-fartøykanaler i ytrehøyreruten slik at bare blodårene kan ses. Bestem innstillingene for vesselvolumprotokollen på samme måte som for Tumor Volume-protokollen som tidligere er beskrevet, og lagre denne protokollen som fartøyvolum.Fjern protokollen, og trekke en avkastning rundt xenograft, ta vare på ikke å inkludere noen ikke-tumor autofluorescence. Hvis du vil måle summen av volumet av objektene i tumorkanalen i denne avkastningen, klikker du kategorien Målinger, velger kommandoen Gjenopprett protokoll, velger Tumorvolum-protokollen og klikker Gjenopprett. Ved hjelp av den nye avkastningen som er laget av Tumor Volume-protokollen, klikker du kategorien Målinger og velger kommandoen Gjenopprett protokoll, velger Fartøyets volumprotokoll og klikker på sumraden for å beregne det totale volumet av objekter i karkanalen inne i denne avkastningen.Del karvolumet med tumorvolumet, og multipliser svaret med 100 for å oppnå en prosentverdi av graftvaskularisering. Ved å forestille seg en individuell xenograft på seks, 24 og 48 timer etter implantasjon, kan angiogen respons på forskjellige tidspunkter beregnes, med den største angiogene responsen mellom 24 til 48 timer etter implantasjon og maksimale nivåer av graftvaskularisering sett rundt 48 timer. Konfokal tidsforløp av en B16-F1 xenograft implantert i en to dager etter befruktning sebrafisk embryo viser GFP-merkede blodkar vokser gjennom xenograft, danner et kronglete nettverk med fartøy av uregelmessig størrelse og morfologi typisk for unormal vaskulært nettverk sett i pattedyr svulster.Xenografts inkubert i VEGFR-hemmeren viser stor karreduksjon sammenlignet med kontroll xenografter inkubert i DMSO. I kontroll embryoer, Det var en ekspansiv vaskulær nettverk som strekker seg over hele xenograft regionen, den typiske angiogene responsen observert etter implantasjon av B16-F1 celler. Når kvantifisert, angiogen respons viser en klar reduksjon i graft vaskularisering i VEGFR inhibitor-behandlet xenografts sammenlignet med kontroller.Tumorkanalen viser en masse B16-F1-celler fluorescerende merket under eggeplommesecen, som viser autofluorescens. Derfor må en avkastning forsiktig trekkes rundt xenograft, og pass på at du ikke inkluderer noen av autofluorescence fra eggeplommesekken. Tumor Volume-protokollen identifiserte alle B16-F1-cellene i avkastningen, målte volumet og klippet avkastningen til volumet.Tumor Vessel Volume Protocol i denne nye klippet ROI tillot identifisering av alle fartøyene forbundet med massen av B16-F1 celler og målte volumet. Verdiene fra Tumor Volume og Tumor Vessel Volume protokoller kan brukes til å gi et mål på graft vaskularisering. Den genetiske tractability og permeability av sebrafisk tillate undersøkelse av høye signalveier i tumor angiogenese, og det kan også fungere som en screening plattform for å identifisere anti-angiogene forbindelser.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklidenes-fluorescens Reporter genet å spore svulst progresjon i gnager svulst modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescens molekylær tomografi ved i Vivo avbildning av glioblastom Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Utnyttelse av ultralyd guidet vev-rettet mobilnettet implantasjon for etablering av biologisk relevante metastatisk svulst Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Berikelse og karakterisering av svulst immun og ikke-immune Microenvironments i etablerte subkutan Murine svulster

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Langsgående Intravital Imaging av Brain tumor Cell atferd som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Overføring av manipulert tumor-Associated nøytrofile til tumor-bærende mus for å studere deres angiogenic potensial in vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Forbedret levedyktighet for Ex vivo 3D hydrogelkulturer av pasientavledede Xenografts i en perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...