Name: in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts
Uploaded: 2019-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts at JoVE.com

Agradecemos al Sr. Alhad Mahagaonkar por administrar las instalaciones de peces cebra de la Universidad de Auckland y la Unidad de Investigación de Imágenes Biomédicas de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Auckland, por su asistencia en la microscopía confocal de lapso de tiempo. Este trabajo fue apoyado por una subvención del proyecto del Consejo de Investigación Sanitaria de Nueva Zelanda (14/105), una Beca de Proyecto del Fondo Marsden de la Royal Society of New Zealand (UOA1602) y una Beca de Proyecto de la Fundación de Investigación Médica de Auckland (1116012) otorgada a J.W.A.

1. Preparación de agujas de microinyección
<ol><li>Encienda un tirador de micropipeta y ajuste los siguientes parámetros (calibrados para el modelo de tirador de micropipeta enumerados en Tabla de materiales:Calor, 680; Tire, 75; Velocidad, 40; Tiempo, 55; Presión: 530.</li>
	<li>Asegure un capilar de vidrio borosilicato en el tirador de micropipetas y tire del capilar para hacer dos agujas. Repita el procedimiento para tantas agujas como desee.</li>
</ol>2. Cultivo celular pa...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sunitinib+acts+primarily+on+tumor+endothelium+rather+than+tumor+cells+to+inhibit+the+growth+of+renal+cell+carcinoma.">Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).</li><li>Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+tumor+xenografts+induce+neovascularization+in+zebrafish+embryos.">Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos.</a> Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish.">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li><li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegfd+can+compensate+for+loss+of+Vegfc+in+zebrafish+facial+lymphatic+sprouting.">Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting.</a> Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).</li><li>Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barbigerone+inhibits+tumor+angiogenesis,+growth+and+metastasis+in+melanoma.">Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKLB1002,+a+novel+potent+inhibitor+of+VEGF+receptor+2+signaling,+inhibits+angiogenesis+and+tumor+growth+in+vivo.">SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).</li><li>Muthukumarasamy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noreremophilane-based+inhibitors+of+angiogenesis+using+zebrafish+assays.">Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).</li><li>Britto, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+enhance+Vegfa-driven+angiogenesis+in+an+embryonic+zebrafish+tumor+xenograft+model.">Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (12), (2018).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NXT2+is+required+for+embryonic+heart+development+in+zebrafish.">NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li><li>Eng, T. C. Y., Astin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Zebrafish+Facial+Lymphatics.">Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics.</a> Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors.">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768 (2011).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRN951,+a+highly+potent+inhibitor+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+tyrosine+kinases,+has+antitumor+activities+and+affects+functional+vascular+properties.">KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties.</a> Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+inflammatory+lymphangiogenesis.">A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis.</a> Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).</li><li>Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+architecture+of+human+xenotransplanted+tumors:+histological,+morphometrical,+and+ultrastructural+studies.">The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).</li><li>Vermeulen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvessel+quantification+in+primary+colorectal+carcinoma:+an+immunohistochemical+study.">Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study.</a> British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).</li><li>Heilmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+System+for+Studying+Metastasis+Using+Transparent+Zebrafish.">A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish.</a> Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).</li><li>Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Zebrafish+to+Identify+Anti-(Lymph)Angiogenic+Compounds+for+Cancer+Treatment:+Promise+and+Future+Challenges.">Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges.</a> Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cords+Promote+Tumor+Initial+Growth+prior+to+Vascular+Function+through+a+Paracrine+Mechanism.">Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism.</a> Scientific Reports. 6, 19404 (2016).</li><li>Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+normalization+as+a+therapeutic+strategy+for+malignant+and+nonmalignant+disease.">Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).</li><li>Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+vascular+networks+in+zebrafish:+an+introduction+to+microangiography.">Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography.</a> Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).</li></ol>

El primer paso crítico en el protocolo es la implantación de células tumorales. Es esencial que las células se inyecten en un lugar que permita que el xenoinjerto se implante con éxito en el embrión sin hacer que el embrión sea edematoso. Una inyección demasiado anterior puede permitir que las células se muevan hacia el corazón, bloqueando el torrente sanguíneo y provocando edema, mientras que una inyección demasiado posterior dará lugar a un xenoinjerto mal implantado. Una inyección anterior se evita mejor...

La angiogénesis es una de las señas de identidadclásicas del cáncer y representa un objetivo de la terapia contra el cáncer 1,2. Para estudiar este proceso, se han creado modelos de xenoinjerto de cáncermediante la implantación de células tumorales de mamíferos en animales como ratones 3. También se ha desarrollado un modelo de xenoinjerto de pez cebra, que implica la implantación de células tumorales en 2 días después de la fertilización (dpi) peces cebra que resulta en el crecimiento rápido de los vasos sanguíneos del pez cebra en el xenoinjerto4.
Este protocolo describe un modelo de xenoinjerto tumoral de embrión de pez cebra in vivo en el que la respuesta angiogénica se puede cuantificar con precisión en todo el xenoinjerto. Este método permite al investigador examinar, in vivo, los mecanismos moleculares que sustentan la respuesta angiogénica tumoral. La traibilidad genética del pez cebra permite interrogar la contribución del huésped, mientras que la selección de diferentes líneas celulares tumorales permite examinar también la contribución tumoral a la angiogénesis5,6,7. Además, como las larvas de pez cebra son permeables a moléculas pequeñas, se pueden utilizar inhibidores de víaespecíficos específicos o se pueden analizar bibliotecas de medicamentos para identificar nuevos inhibidores de la angiogénesis tumoral8,9,10, 11.
El modelo de xenoinjerto de embrión de pez cebra presenta ventajas únicas en comparación con otros modelos de xenoinjerto de mamíferos. Los xenoinjertos de pez cebra son más baratos y fáciles de realizar,se puede examinar un gran número de animales y las imágenes de células vivas permiten un examen detallado del comportamiento celular 4. A diferencia de otros modelos in vivo, que requieren hasta varias semanas para observar un crecimiento significativo de los vasos, se puede observar angiogénesis en xenoinjertos de peces cebra dentro de las 24 horas después de la implantación3,4. Sin embargo, la falta de un sistema inmunitario adaptativo en el pez cebra embrionario, aunque beneficioso para mantener el xenoinjerto, significa que no se puede examinar la respuesta inmune adaptativa y su contribución a la angiogénesis tumoral. Además, la falta de células estromales tumorales, la incapacidad para implantar ortotótopopicamente el tumor y la diferencia en la temperatura de mantenimiento entre el pez cebra y las células de mamíferos son posibles debilidades de este método. Sin embargo, la amenabilidad de este modelo para la toma de imágenes en vivo y la capacidad de cuantificar con precisión la respuesta angiogénica hace que sea excepcionalmente beneficioso para el estudio de los procesos celulares que regulan la angiogénesis tumoral in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>011G</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16-F1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillaries</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100T-4</td>
			<td>OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -35 mm diameter</td>
			<td>Thermofisher NZ</td>
			<td>NUN153066</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish -100 mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167-500EA</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>In Vitro Technologies</td>
			<td>COR430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 &#956;M in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Drug treatment, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 
			 
			1.6 g KCl 
			 
			5.8 g CaCl2&#183;2H2O 
			 
			9.78 g MgCl2&#183;6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH</td>
			<td>In house [1]</td>
			<td></td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Xenotransplantation, Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1491</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 200 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1489</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 10 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1487</td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Preparation of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (NZ origin)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10091148</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer</td>
			<td>HawksleyVet</td>
			<td>AC1000</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>75004500</td>
			<td>Cell culture, Cell labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 &#956;g/ml in serum-free media)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point, UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methycellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9004 67 5</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader 0.5-20 &#956;L pipette tip for loading microcapillaries</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Used during multiple steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller P 87</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any commercial brand</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3516</td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Media (MEM) - alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>12561056</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narishige micromanipulator</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td></td>
			<td>Xenotransplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 pipet filler</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>9501</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4485</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological stripette 2 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4486</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Needle 22 gauge</td>
			<td>Amtech</td>
			<td>SH 182</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Thermofisher Scientfic</td>
			<td>HeraCell 150i</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tivozanib (AV951)</td>
			<td>AVEO Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Drug treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3 mL</td>
			<td>Mediray</td>
			<td>RL200C</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.25% )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Fish husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Software (v6.3)</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging and quantitation of the host angiogenic response in zebrafish tumor xenografts

La angiogénesis tumoral es un objetivo clave de la terapia contra el cáncer y este método ha sido desarrollado para proporcionar un nuevo modelo para estudiar este proceso in vivo. Un xenoinjerto de pez cebra se crea implantando células tumorales de mamíferos en el espacio perivitelina de dos embriones de pez cebra de post-fertilización de días, seguido de medir la extensión de la respuesta angiogénica observada en un punto final experimental de hasta dos días postimplantación. La ventaja clave de este método es la capacidad de cuantificar con precisión la respuesta angiogénica del huésped de pez cebra al injerto. Esto permite un examen detallado de los mecanismos moleculares, así como de la contribución del huésped contra el tumor a la respuesta angiogénica. Los embriones xenoinjerados pueden ser sometidos a una variedad de tratamientos, como la incubación con posibles fármacos anti-angiogénesis, con el fin de investigar estrategias para inhibir la angiogénesis tumoral. La respuesta angiogénica también puede ser imagen en vivo con el fin de examinar procesos celulares más dinámicos. La técnica experimental relativamente poco exigente, los costos de mantenimiento baratos del pez cebra y la breve línea de tiempo experimental hacen que este modelo sea especialmente útil para el desarrollo de estrategias para manipular la angiogénesis tumoral.

Mediante la toma de imágenes de un xenoinjerto individual a 6, 24 y 48 hpi, la respuesta angiogénica en diferentes puntos de tiempo se puede calcular como se muestra en la Figura 1A-C. La respuesta angiogénica más grande se observa entre 24-48 h después de la implantación, con los niveles máximos de vascularización del injerto observados alrededor de 2 dpi (Figura1A-C). Una película de l...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts at JoVE.com

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

El objetivo de este método es generar un modelo in vivo de angiogénesis tumoral mediante células tumorales de mamíferos xenografting en un embrión de pez cebra que tiene vasos sanguíneos marcados fluorescentemente. Mediante la toma de imágenes del xenoinjerto y los vasos asociados, se puede obtener una medición cuantitativa de la respuesta angiogénica.

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Este protocolo describe cómo se pueden utilizar las larvas transgénicas de peces cebra para proporcionar un ensayo cuantitativo in vivo de la vascularización del xenoinjerto tumoral. La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas anteriores es que permite al investigador cuantificar con precisión los cambios en los niveles de vascularización del xenoinjerto. El paso clave es asegurar que las células tumorales se inyectan correctamente en larvas de pez cebra para que los pasos posteriores de diagnóstico por imágenes y cuantificación no se vean comprometidos.Después de cultivar y etiquetar células B16-F1 con tinte fluorescente, comience a preparar embriones para la implantación. Llene un plato de 35 milímetros con una solución de 2% metilcelulosa en E3 a una cuarta parte del volumen del plato. Con una pipeta de transferencia, coloque aproximadamente 50 embriones transgénicos previamente preparados en la metilcelulosa mientras minimiza el volumen de la solución E3 transferida.Usando una punta de pipeta microcapillar, organizar los embriones de modo que todos estén orientados verticalmente con la cabeza hacia arriba, colas hacia abajo, y el embrión con su lado izquierdo hacia arriba. Agregue 50%ECM a un pellet de célula B16-F1 previamente preparado para producir una mezcla de células a ECM en una proporción de dos a uno. Mezclar bien pipeteando y revolviendo, y almacenar la mezcla en hielo.Utilice una pipeta microcapillar para tomar hasta tres a 10 microlitros de células. Inserte cuidadosamente la punta de la pipeta en una aguja de microinyección previamente preparada y luego expulse la mezcla de matriz B16-F1 en el extremo de la aguja. Inserte la aguja en el soporte de la aguja e incline en un ángulo de 45 grados con respecto al plato.Use pinzas para romper la punta de la aguja para hacer un agujero lo suficientemente grande como para que las células sean expulsadas de la aguja sin apretar las células. Encienda el cilindro de aire presurizado conectado al aparato de inyección y, a continuación, encienda momentáneamente el inyector en modo continuo durante no más de un segundo para empujar las células a la punta de la aguja. Apunte la aguja hacia el saco de yema de un embrión, y empújela a través del saco de yema en una dirección ventral hasta que la punta de la aguja haya emergido del saco de la yema y esté empujando la epidermis embrionaria en el lado ventral del embrión, sólo posterior al corazón.Empuje cuidadosamente y ligeramente la punta de la aguja hacia adelante hasta que haya creado un pequeño espacio entre la epidermis y la membrana del saco de yema. Pulse el inyector para expulsar parte de la mezcla celular en este espacio de perivitellina. Observe cuidadosamente el tamaño, la forma y la ubicación del xenoinjerto a medida que se está implantando, y ajuste el número de pulso y la posición de la aguja en consecuencia para asegurar un xenoinjerto correctamente implantado.Repita los pulsos hasta que se hayan inyectado entre 500 y 800 células en el espacio de la perivitellina, creando una protuberancia visible que se extiende al menos la mitad del camino a lo largo de la parte inferior del saco de yema. Retire la aguja del embrión. Después de inyectar todos los embriones, utilice una punta de pipeta microcapilar para empujar todos los embriones juntos para que puedan ser pipetados con la menor metilcelulosa posible.Transfiera los embriones a un plato de recuperación que contenga E3 con PTU y azul de metileno. A continuación, pipetee suavemente E3 alrededor de los embriones para lavarlos, y luego incubar a 34 grados centígrados. A continuación, imagine embriones anestesiados utilizando un microscopio confocal.Utilice un canal láser adecuado para que las células tumorales determinen un volumen a tomar imágenes, lo que permite al menos una o dos secciones ópticas a ambos lados del injerto. Utilice intervalos de sección que estén separados por unos cinco micrómetros para crear una pila Z. Utilice imágenes de dos canales para tomar imágenes tanto de los vasos sanguíneos como del xenoinjerto tumoral.Imagen del xenoinjerto tumoral y los vasos sanguíneos de una larva, y repita estos pasos para cada larva a tomar imágenes. Para comenzar con la cuantificación de la respuesta angiogénica al xenoinjerto de pez cebra, transfiera los archivos de imagen confocal de pila Z creados previamente de un xenoinjerto tumoral a una nueva carpeta en el software de análisis de imágenes 3D. Para crear el protocolo de volumen tumoral para medir el volumen de xenoinjerto tumoral, vaya a la pestaña Medición en el menú superior de la ventana y, a continuación, desde la lista de protocolos que aparece, arrastre el protocolo denominado Buscar objetos al espacio que se titula Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones.Después de asegurarse de que este protocolo está configurado para medir objetos en el canal tumoral, arrastre los protocolos denominados Clip To ROIs y Make ROI From Population desde la lista de protocolos hasta el espacio Drag Tasks Here To Make Measurements, asegurándose de que estos dos comandos se aplican a los objetos identificados por Buscar objetos. Antes de calibrar la configuración de este protocolo, vaya al menú desplegable situado encima de la etiqueta Modo en la parte superior izquierda de la ventana y seleccione la vista Enfoque extendido. Anule la selección de los canales no tumorales en el panel del extremo derecho haciendo clic en el círculo negro debajo de cada encabezado del canal para que solo se pueda ver el canal tumoral.A continuación, utilice la herramienta Mano alzada en la parte superior de la ventana para dibujar una región de interés, o ROI, alrededor de todo el volumen del tumor. En el panel debajo de la imagen, seleccione la etiqueta Resumen y, a continuación, establezca la opción Mostrar para mostrar la población dos. Para calibrar, en la tarea Buscar objetos, haga clic en el asterisco para abrir la ventana de configuración.Ajuste el umbral utilizando la intensidad y determine el umbral inferior hasta que solo se seleccionen las células tumorales y no la fluorescencia de fondo. Determine el tamaño mínimo del objeto para que solo se miden las celdas intactas, a diferencia de los elementos más pequeños de los desechos de celda, estableciendo el tamaño mínimo del objeto como 100 micrómetros cúbicos. Guarde este protocolo como Volumen de tumor haciendo clic en la pestaña Mediciones del menú superior y haciendo clic en Guardar protocolo.Utilice los mismos ajustes para medir todos los xenoinjertos. Para medir el volumen de los vasos sanguíneos asociados al xenoinjerto, cree un nuevo protocolo yendo al menú superior y luego haciendo clic en la pestaña Dimensiones y luego en Protocolo claro. Arrastre las tareas Buscar objetos y Recortar a ROI al espacio que se titula Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones para este protocolo.Asegúrese de que el primer comando está configurado para medir objetos en el canal del vaso sanguíneo y que el siguiente comando está configurado para aplicarse a los objetos identificados por el primer comando. A continuación, anule la selección de los canales que no son vasos en el panel del extremo derecho para que solo se puedan ver los vasos sanguíneos. Determine la configuración del protocolo de volumen de recipiente de una manera similar a la del protocolo de volumen tumoral descrito anteriormente y guarde este protocolo como volumen de recipiente.Borre el protocolo y dibuje un ROI alrededor del xenoinjerto, teniendo cuidado de no incluir ninguna autofluorescencia no tumoral. Para medir la suma del volumen de los objetos del canal tumoral dentro de este ROI, haga clic en la pestaña Dimensiones, seleccione el comando Restaurar protocolo, elija el protocolo Volumen de tumor y haga clic en Restaurar. Con el nuevo ROI realizado por el protocolo Tumor Volume, haga clic en la pestaña Dimensiones y seleccione el comando Restaurar protocolo, elija el protocolo De volume de la embarcación y haga clic en la fila de suma para calcular el volumen total de objetos en el canal del buque dentro de este ROI.Divida el volumen del vaso por el volumen del tumor y multiplique la respuesta por 100 para obtener un valor porcentual de la vascularización del injerto. Mediante la toma de imágenes de un xenoinjerto individual a las seis, 24 y 48 horas después de la implantación, se puede calcular la respuesta angiogénica en diferentes puntos de tiempo, con la mayor respuesta angiogénica entre 24 y 48 horas después de la implantación y los niveles máximos de vascularización del injerto observados alrededor de 48 horas. Las imágenes de lapso de tiempo confocales de un xenoinjerto B16-F1 implantados en un embrión de pez cebra después de la fertilización de dos días muestran que los vasos sanguíneos etiquetados por GFP crecen a través del xenoinjerto, formando una red de torsión con vasos de tamaño irregular y morfología típicos de la red vascular anormal observada en tumores de mamíferos.Los xenoinjertos incubados en el inhibidor VEGFR muestran una gran reducción del vaso en comparación con los xenoinjertos de control incubados en DMSO. En los embriones de control, hubo una red vascular expansiva que se extendió por toda la región del xenoinjerto, la respuesta angiogénica típica observada después de la implantación de células B16-F1. Cuando se cuantifica, la respuesta angiogénica muestra una clara reducción de la vascularización del injerto en los xenoinjertos tratados con inhibidores VEGFR en comparación con los controles.El canal tumoral muestra una masa de células B16-F1 etiquetadas fluorescentemente debajo del saco de yema, que muestra autofluorescencia. Por lo tanto, un ROI debe ser cuidadosamente dibujado alrededor del xenoinjerto, teniendo cuidado de no incluir ninguna de las autofluorescencias del saco de yema. El protocolo tumoral identificó todas las celdas B16-F1 en el ROI, midió su volumen y recortó el ROI a su volumen.El protocolo de volumen de recipientes tumorales en este nuevo ROI recortado permitió la identificación de todos los recipientes asociados con la masa de células B16-F1 y midió su volumen. Los valores de los protocolos Volumen tumoral y Volumen de vasos tumorales se pueden utilizar para dar una medida de la vascularización del injerto. La capacidad de contabilidad genética y la permeabilidad del pez cebra permiten la investigación de vías de alta señalización en la angiogénesis tumoral, y también puede actuar como una plataforma de cribado para identificar compuestos anti-angiogénicos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Gen reportero de radionúclido-fluorescencia de imagen para seguir la progresión del Tumor en modelos de roedores Tumor

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tomografía Molecular de la fluorescencia para obtener imágenes In Vivo de xenoinjertos de Glioblastoma

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Enriquecimiento y caracterización de los microambientes Tumor inmunes y no inmunes en tumores murinos subcutáneos establecidos

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Transferencia de neutrófilos asociados a tumores manipulados a ratones portadores de tumores para estudiar su potencial angiogénico en Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...