Name: intravital imaging of intraepithelial lymphocytes in murine small intestine
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pela NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Agradecemos a Madeleine Hu por sua ajuda na edição do manuscrito e no fornecimento dos dados mostrados nos resultados representativos.

Todos os estudos foram conduzidos em uma associação de avaliação e acreditação de laboratório de cuidados com animais (AALAC)-instalações credenciadas de acordo com protocolos aprovados pela Rutgers New Jersey Medical School recursos de medicina comparativa.
1. preparação do mouse
Nota: O procedimento a seguir, incluindo preparação e cirurgia de animais, levará de 30 a 40 min. antes da cirurgia, ligue o microscópio e aqueça a incubador...

<ol>
	<li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes.">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).</li><li>Hu, M. D., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sentinels+at+the+frontline:+the+role+of+intraepithelial+lymphocytes+in+inflammatory+bowel+disease.">Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease.</a> Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).</li><li>Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+the+intestinal+mucosa+by+intraepithelial+gamma+delta+T+cells.">Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).</li><li>Swamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+intraepithelial+lymphocyte+activation+promotes+innate+antiviral+resistance.">Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance.</a> Nature Communications. 6, 7090 (2015).</li><li>Dalton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+gammadelta++lymphocytes+maintain+the+integrity+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+in+response+to+infection.">Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection.</a> Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).</li><li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice.">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75 (2), 274-282 (1993).</li><li>Willcox, B. E., Willcox, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+TCR+ligands:+the+quest+to+solve+a+500-million-year-old+mystery.">gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery.</a> Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1-dependent+occludin+endocytosis+is+required+for+TNF-induced+tight+junction+regulation+in+vivo.">Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLCK-dependent+exchange+and+actin+binding+region-dependent+anchoring+of+ZO-1+regulate+tight+junction+barrier+function.">MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).</li><li>Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+dendritic+cell+extension+into+the+small+bowel+lumen+in+response+to+epithelial+cell+TLR+engagement.">Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).</li><li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+migration+of+gammadelta+intraepithelial+lymphocytes+requires+occludin.">Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).</li><li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Migration+Limits+Transepithelial+Pathogen+Invasion+and+Systemic+Disease+in+Mice.">gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice.</a> Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).</li><li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+IL-15+Is+a+Critical+Regulator+of+gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Motility+within+the+Intestinal+Mucosa.">Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus.">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).</li><li>Sandrock, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+reveal+origin,+persistence+and+non-redundant+functions+of+IL-17-producing+gammadelta+T+cells.">Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).</li><li>Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR18+is+required+for+a+normal+CD8alphaalpha+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+compartment.">GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).</li><li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR55+regulates+intraepithelial+lymphocyte+migration+dynamics+and+susceptibility+to+intestinal+damage.">GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage.</a> Sci Immunol. 2 (18), (2017).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Lodolce, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+receptor+maintains+lymphoid+homeostasis+by+supporting+lymphocyte+homing+and+proliferation.">IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation.</a> Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).</li><li>Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-presentation+of+IL-15+by+intestinal+epithelial+cells+drives+development+of+CD8alphaalpha+IELs.">Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).</li><li>Knoop, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+promote+the+sampling+of+luminal+antigens+and+bacteria+via+colonic+goblet+cell+associated+antigen+passages.">Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages.</a> Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).</li><li>Sujino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+adaptation+of+regulatory+and+intraepithelial+CD4(+)+T+cells+controls+gut+inflammation.">Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation.</a> Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Requirements+of+TCR+Signaling+in+Homeostatic+Maintenance+and+Function+of+Dendritic+Epidermal+T+Cells.">Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).</li><li>Chennupati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercompartmental+movement+of+gammadelta+T+cells:+intestinal+intraepithelial+and+peripheral+gammadelta+T+cells+represent+exclusive+nonoverlapping+populations+with+distinct+migration+characteristics.">Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics.</a> Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).</li><li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract.">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li></ol>

O desenvolvimento de técnicas de microscopia intravital proporcionou uma oportunidade inédita de observar a reorganização das estruturas subcelulares8,9,22, interações célula-celular12, 25 e comportamento migratóriocelular 13,14,15,16<...

Os linfócitos intraepithelial (IEL) são situados dentro do epitélio intestinal, e são encontrados ao longo da membrana do porão e entre pilhas epithelial adjacentes no espaço intercelular lateral1. Há aproximadamente um IEL para cada 5-10 pilhas epithelial; Estes IELs servem como sentinelas para fornecer a fiscalização imune da grande extensão da barreira epithelial intestinal2. Os IELs que expressam o receptor da célula ltγδ T (TCR) compreendem até 60% da população total de IEL no intestino delgado murino. Estudos em camundongos T-Cell-deficientes ltγδ demonstram um papel de grande proteção dessas células em resposta a lesão intestinal, inflamação e infecção3,4,5. Apesar da geração do mouse nocaute Tcrd 6, nossa compreensão da biologia ltγδ IEL permanece limitada devido, em parte, ao fato de que os ligantes reconhecidos pelo ltγδ TCR ainda não foram identificados7. Como resultado, a falta de ferramentas para estudar esta população celular dificultou a investigação do papel da ativação e função do ltγδ TCR condições fisiológicas e patológicas. Para preencher essa lacuna, desenvolvemos técnicas de imagem ao vivo para visualizar o comportamento migratório de ltγδ IEL e interações com enterócitos vizinhos como um meio para fornecer informações adicionais sobre a função ltγδ IEL e responsividade aos estímulos externos in vivo.
Durante a última década, a imagem latente Intravital expandiu significativamente nossa compreensão dos eventos moleculars envolvidos em facetas múltiplas da biologia intestinal, incluindo o derramamento epithelial8da pilha, regulamento da função epithelial 9 da barreira ,10, amostragem de células mielóides de conteúdo Luminal11,12e interações hospedeiro-micróide11,13,14,15,16 . No contexto da biologia de IEL, o uso da microscopia intravital tem derramado luz sobre a dinâmica espaciotemporal da motilidade de IEL e os fatores que mediam o seu comportamento de vigilância13,14,15, a 16. O desenvolvimento de camundongos de repórter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), que rotula ltγδ IELs pela expressão nuclear de GFP17, revelou que Ltγδ IELS são altamente motile dentro do epitélio e exibem um comportamento de vigilância único que é responsivo a microbiana infecção17,13,14. Recentemente, um outro rato do repórter da pilha de ltγδ T foi desenvolvido (Tcrd-GDL) que expressa GFP no citoplasma para permitir o visualização da pilha inteira18. Metodologia semelhante tem sido utilizada para investigar a exigência de receptores específicos de quimiocina, como o receptor acoplado à proteína G (GPCR)-18 e-55, sobre a dinâmica da motilidade de IEL19,20. Na ausência de um repórter Cell-specific, os anticorpos conjugado fluorescentes de encontro a CD8α foram usados para visualizar e seguir a motilidade de IEL in vivo19,20. Embora a microscopia de varredura do laser do dois-fóton seja usada geralmente para a imagem latente intravital, o uso da microscopia confocal do laser do disco de giro fornece vantagens originais para capturar imagens multicanal de alta velocidade e de alta resolução com ruído de fundo mínimo. Esta tecnologia é ideal para elucidar a dinâmica espaciotemporal das interações imunológicas/epiteliais dentro do complexo microambiente da mucosa intestinal. Além disso, através do uso de vários modelos transgênicos e/ou Knockout mouse, esses estudos podem fornecer informações sobre a regulação molecular da função intestinal imune e/ou células epiteliais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm dish, No. 1.5 Coverslip</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 Hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27g</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin Syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50822501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enclosed incubation chamber</td>
			<td>OKOLAB</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7983-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55037C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted DMi8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IQ3 (v. 3.6.3)</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Putney</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas scissors 3&#8221; (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0798934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Forceps 4.25&#8221; (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td>Lubricating Eye Ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of intraepithelial lymphocytes in murine small intestine

Os linfócitos intraepithelial que expressam o receptor da pilha de ltγδ T (ltγδ IEL) jogam um papel chave na fiscalização imune do epitélio intestinal. Devido, em parte, à falta de um ligantes definitivo para o receptor de células ltγδ T, nossa compreensão da regulação da ativação ltγδ IEL e sua função in vivo permanece limitada. Isso requer o desenvolvimento de estratégias alternativas para interrogar as vias de sinalização envolvidas na regulação da função ltγδ IEL e a responsividade dessas células ao microambiente local. Embora os IELS do ltγδ sejam compreendidos extensamente para limitar o translocation do micróbio patogénico, o uso da imagem latente intravital tem sido crítico a compreender a dinâmica armazenamento de interações de IEL/epithelial no estado estacionário e em resposta aos micróbios patogénicos invasores. Nisto, nós apresentamos um protocolo para visualizar o comportamento migratório de IEL na mucosa intestinal pequena de um rato do repórter da pilha de GFP ltγδ T usando a microscopia de laser confocal invertida do disco de giro. Embora a profundidade máxima da imagem latente desta aproximação seja limitada relativo ao uso da microscopia do laser-exploração do dois-fóton, a microscopia confocal do laser do disco de giro fornece a vantagem da aquisição de imagem de alta velocidade com photobranqueamento reduzido e photodamage. Usando o software da análise de imagem 4D, o comportamento da fiscalização da pilha de T e suas interações com pilhas vizinhas podem ser analisados depois da manipulação experimental para fornecer a introspecção adicional na ativação e na função de IEL dentro da mucosa intestinal.

Usando a imagem latente intravital de ratos do repórter de tcrdegfp, nós mostramos previamente que ltγδ IELS exibem um comportamento dinâmico da fiscalização, em que patrulham o epitélio migrando ao longo da membrana do porão e no espaço intercelular lateral (LIS) em constante Estado (Figura 2, filme 1).
Essa abordagem também pode ser usada para avaliar como a inibição de vias de sinalização celular específica e/ou receptores influ...

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Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

A microscopia intravital da pequena mucosa intestinal pode fornecer uma visão da dinâmica espesso das interações celulares dentro do epitélio entre diferentes tipos de células imunes, ou entre esses dois compartimentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a aquisição de imagens de alta velocidade e alta resolução dentro da mucosa intestinal em tempo real. Imagens ao vivo do intestino podem fornecer informações adicionais sobre as interações celulares, ou sinalização celular envolvida na imunidade mucosa, biologia epitelial ou biologia do câncer.Trata-se de um método desafiador que requer a prática da técnica cirúrgica, bem como paciência e posicionamento ideal do mouse para aquisição de imagem. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um rato transgênico anestesiado, expressando uma proteína fluorescente verde aprimorada, ou EGFP, receptor de células T Gamma-delta, use uma seringa tuberculina para injetar lentamente 200 microliters de Hoechst 33342 Dye Solution recém-preparada no seio venoso retro-orbital. De um a dois minutos após a injeção, aplique pomada nos olhos do animal para evitar que eles sequem.Em seguida, faça uma incisão vertical de 2CM através da pele e do peritônio, ao longo da linha média do abdômen inferior e use fórceps angulares para retirar cuidadosamente o caecum da cavidade peritoneal. Identifique uma área de 2-3CM do intestino delgado que contenha conteúdo fecal mínimo, tomando cuidado para não rasgar os vasos sanguíneos mesenéricos, e devolva cuidadosamente o caecum e o intestino delgado restante para a cavidade peritoneal, deixando o segmento de interesse externalizado. Colocando dois pares de fórceps em ambos os lados do mesentery sublinhado entre os vasos sanguíneos, esfregue suavemente as pontas dos fórceps juntos para criar um buraco na membrana.Usando fórceps angulares e uma agulha de ponto de fita curva presa a uma sutura de 5CM, penetre um lado do peritônio através do orifício na membrana, e até o outro lado do revestimento peritônio, colocando uma sutura na parte superior, e outra perto do fundo da incisão para fechar a incisão, mantendo o laço do intestino externalizado. Para aumentar a probabilidade de sucesso, não amarre ou rasgue nenhum vaso sanguíneo ao colocar a sutura abdominal e limite qualquer manuseio ím loc. Em seguida, feche a pele sob a alça intestinal da mesma forma, colocando uma sutura no meio da incisão entre as suturas anteriores no peritônio sublinhado.Usando um eletrocauteno, faça uma linha de perfuração ao longo da fronteira antimesenteric e aplique imediatamente algumas gotas de água na superfície do intestino para evitar danos adicionais nos tecidos induzidos pelo calor. Borrida com um kimwipe para remover água residual. Use uma tesoura de vanna para cortar uma fenda horizontal de aproximadamente 1,5CM na borda distal do tecido cauterizado, ao longo do comprimento da linha cauterizada, em direção à extremidade proximal do segmento tecidual externalizado.Quando a superfície mucosa estiver exposta, cubra o abdômen com um kimwipe úmido para manter o tecido hidratado. Para a Imagem de Microscopia Confocal do Disco Giratório, transporte o mouse para o microscópio em um vaso coberto. Inicie o software de imagem e incline a cabeça do microscópio para trás, e adicione 150 microlitros de 1 maçaria de pulgas de micromolar Alexa Fluor e a solução salina tampão da Hank no fundo escorregado da tampa de vidro.Posicione o mouse para que a superfície mucosa aberta entre em contato diretamente com a mancha de cobertura. Coloque o mouse e o prato sobre o palco de imagem em uma incubadora pré-aquecida. Defina a intensidade de excitação e o tempo de exposição de cada laser em não mais de 10-15 miliwatts e 120-150 milissegundos, respectivamente, e ajuste a Média do Quadro para 2.Ligue a função Ganho de Multiplicação eletrônica para reduzir o ruído de fundo e selecione a Calibração Objetiva 63X para garantir uma medição correta do tamanho do pixel. Utilizando o laser de 405 nanômetros e o objetivo do ar 20X, visualize manualmente os núcleos para localizar um campo de villi que carece de movimento ou deriva perceptível, evitando áreas de movimento artefatoual devido à respiração, peristalse ou batimentos cardíacos. Usando o X-Y Scan, registe a coordenada X-Y do campo de interesse e mude para o objetivo de imersão 63X de glicerol.Adquira uma imagem ao vivo no canal de 405 nanômetros por até 1 minuto para confirmar que os villi no campo selecionado são estáveis, enquanto ajustam o foco para encontrar o plano ortogonal logo abaixo da ponta villus. Em seguida, adquira pilhas z, partindo logo abaixo do epitélio da ponta villus, cerca de 15-20 micrômetros até o villus até que seja difícil resolver os núcleos, usando 1,5 passos de micrômetro. 3-5 minutos após o início da aquisição, confirme a estabilidade da imagem e a Motilidade celular intraepithelial Gamma-delta, e continue adquirindo imagens por 30-60 minutos para cada campo de villi.Os linfócitos intraepitheliais gama-delta exibem um comportamento dinâmico de vigilância, no qual patrulham o epitélio migrando ao longo da membrana do porão e para o espaço intercelular lateral em estado de estudo. Nestas imagens representativas, as faixas coloridas indicam os caminhos migratórios de linfócitos intraepitheliais gamma-delta ao longo de 30 minutos. Embora a frequência de linfócitos intraepitheliais no espaço intercelular lateral tenha aumentado em camundongos tratados com anticorpo beta receptor anti-interleucina-2, mais de 30% desses linfócitos intraepitelíacos gama-delta apresentaram um comportamento ocioso.Este fenótipo de marcha ociosa foi confirmado por uma redução significativa tanto na velocidade instantânea quanto na razão de confinamento dos linfócitos intraepitheliais gama-delta, após o bloqueio interleucina-2-receptor, em relação aos controles. Além disso, os linfócitos intraepitheliais gama-delta ociosos tinham tempos mais longos, e eram mais frequentemente localizados dentro do espaço intercelular lateral, em comparação com linfócitos intraepitheliais glifoseíacos motile Gamma-delta. Pode ser difícil identificar campos de villi que não possuem movimento excessivo devido à peristalse.O reposicionamento do mouse pode ajudar na localização de um campo mais estável. Uma análise mais aprofundada dos dados de rastreamento celular pode ajudar a identificar comportamentos específicos de motilidade ou fornecer métricas adicionais para medir as interações celulares. A imagem intravital e a análise da iel-motilidade tornaram-se uma leitura padrão da função IEL, fornecendo insights sobre como a sinalização imunológica inata regula a função IEL Gamma-delta.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Imunologia e Infecção

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murino Linfócitos Rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em&gt; In Vivo</em&gt; Tráfico celular por PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...