Name: intravital imaging of intraepithelial lymphocytes in murine small intestine
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine at JoVE.com

Bu çalışma NıH R21 AI143892, New Jersey Sağlık Vakfı Grant, Busch Biyomedikal Grant (KLE) tarafından desteklenmektedir. Madeleine hu 'ya, el yazması düzenlemede yaptığı yardım ve temsili sonuçlarında gösterilen verileri sağlamak için teşekkür ederiz.

Rutgers New Jersey Tıp Fakültesi Karşılaştırmalı Tıp kaynakları tarafından onaylanan protokollere göre, tüm çalışmalar laboratuar hayvan bakımı (AALAC) değerlendirme ve Akreditasyon Birliği 'nde yapılmıştır.
1. fare hazırlama
Not: Aşağıdaki prosedür, hayvan hazırlığı ve cerrahisi de dahil olmak üzere, 30 – 40 dakika sürer. ameliyattan önce, mikroskobu açın ve 37 °C ' ye mikroskop üzerinde kapalı kuluçta ısı...

<ol>
	<li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes.">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).</li><li>Hu, M. D., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sentinels+at+the+frontline:+the+role+of+intraepithelial+lymphocytes+in+inflammatory+bowel+disease.">Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease.</a> Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).</li><li>Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+the+intestinal+mucosa+by+intraepithelial+gamma+delta+T+cells.">Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).</li><li>Swamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+intraepithelial+lymphocyte+activation+promotes+innate+antiviral+resistance.">Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance.</a> Nature Communications. 6, 7090 (2015).</li><li>Dalton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+gammadelta++lymphocytes+maintain+the+integrity+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+in+response+to+infection.">Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection.</a> Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).</li><li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice.">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75 (2), 274-282 (1993).</li><li>Willcox, B. E., Willcox, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+TCR+ligands:+the+quest+to+solve+a+500-million-year-old+mystery.">gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery.</a> Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1-dependent+occludin+endocytosis+is+required+for+TNF-induced+tight+junction+regulation+in+vivo.">Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLCK-dependent+exchange+and+actin+binding+region-dependent+anchoring+of+ZO-1+regulate+tight+junction+barrier+function.">MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).</li><li>Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+dendritic+cell+extension+into+the+small+bowel+lumen+in+response+to+epithelial+cell+TLR+engagement.">Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).</li><li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+migration+of+gammadelta+intraepithelial+lymphocytes+requires+occludin.">Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).</li><li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Migration+Limits+Transepithelial+Pathogen+Invasion+and+Systemic+Disease+in+Mice.">gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice.</a> Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).</li><li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+IL-15+Is+a+Critical+Regulator+of+gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Motility+within+the+Intestinal+Mucosa.">Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus.">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).</li><li>Sandrock, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+reveal+origin,+persistence+and+non-redundant+functions+of+IL-17-producing+gammadelta+T+cells.">Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).</li><li>Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR18+is+required+for+a+normal+CD8alphaalpha+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+compartment.">GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).</li><li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR55+regulates+intraepithelial+lymphocyte+migration+dynamics+and+susceptibility+to+intestinal+damage.">GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage.</a> Sci Immunol. 2 (18), (2017).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Lodolce, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+receptor+maintains+lymphoid+homeostasis+by+supporting+lymphocyte+homing+and+proliferation.">IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation.</a> Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).</li><li>Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-presentation+of+IL-15+by+intestinal+epithelial+cells+drives+development+of+CD8alphaalpha+IELs.">Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).</li><li>Knoop, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+promote+the+sampling+of+luminal+antigens+and+bacteria+via+colonic+goblet+cell+associated+antigen+passages.">Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages.</a> Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).</li><li>Sujino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+adaptation+of+regulatory+and+intraepithelial+CD4(+)+T+cells+controls+gut+inflammation.">Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation.</a> Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Requirements+of+TCR+Signaling+in+Homeostatic+Maintenance+and+Function+of+Dendritic+Epidermal+T+Cells.">Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).</li><li>Chennupati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercompartmental+movement+of+gammadelta+T+cells:+intestinal+intraepithelial+and+peripheral+gammadelta+T+cells+represent+exclusive+nonoverlapping+populations+with+distinct+migration+characteristics.">Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics.</a> Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).</li><li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract.">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li></ol>

İntravital mikroskopi tekniklerinin geliştirilmesi, hücre içi yapıların8,9,22, hücreli hücre etkileşimleri12' nin yeniden yapılanma izlemek için görülmemiş bir fırsat sağladı 25 ve hücre göç davranışı13,14,15,16,</s...

İntraepitelyal lenfositler (IEL) intestinal epitelin içinde yer alır ve hem Bodrum membranı boyunca hem de lateral hücre içi uzayda bitişik epitelyal hücreler arasında bulunur1. Her 5-10 epitelyal hücreler için yaklaşık bir IEL vardır; Bu iels, intestinal epitelyal bariyer2' nin büyük genişinde bağışıklık gözetimi sağlamak için nöbetçiler olarak hizmet vermektedir. Γδ T hücre reseptörü (TCR) ifade eden IELs, murine ince bağırsaktaki toplam IEL nüfusunun% 60 ' una kadar oluşur. Γδ T-Cell-eksikliği fareler içinde çalışmalar intestinal yaralanma, inflamasyon ve enfeksiyon yanıt olarak bu hücrelerin büyük ölçüde koruyucu rol göstermek3,4,5. Tcrd nakavt fare6neslini rağmen γδ IEL biyolojisinin anlayışımız, γδ TCR tarafından tanınan ligin henüz7tanımlanmasına bağlı olarak sınırlı kalır. Sonuç olarak, bu hücre nüfusunu incelemek için araçların olmaması, fiziksel ve patolojik koşullarda γδ TCR aktivasyonu ve fonksiyonunun rolünü araştırmayı zorlaştırdı. Bu boşluğu doldurmak için γδ IEL göç davranışlarını ve komşu enteranositlerle olan etkileşimleri, γδ IEL fonksiyonu ve dış uyaranlara yanıt verme konusunda ek bilgi sağlamak için bir araç olarak görselleştiren canlı görüntüleme teknikleri geliştirdik.
Son on yıl içinde, intravital görüntüleme önemli ölçüde bağırsak biyolojisinin çoklu yönleriyle ilgili moleküler olayların anlayışımızı genişletti, epitelyal hücre dökülme dahil olmak üzere8, epitelyal bariyer fonksiyonunun düzenlenmesi9 ,10, luminal içeriğin miyeloid hücre örnekleme11,12, ve ev sahibi-mikrobe etkileşimleri11,13,14,15,16 . İel biyolojisi bağlamında, intravital mikroskopi kullanımı, iel motilitesi 'nin yer alan dinamiklerine ve gözetim davranışlarına arabuluculuk edici faktörlere ışık tutmıştır13,14,15, 16 yaşında. TcrdH2BeGFP (tcrdegfp) muhabiri fareler, hangi Etiketler γδ iels nükleer Gfp ifade tarafından17, ortaya γδ iels son derece epitelyum içinde hareketli ve sergiler mikrobiyal duyarlı benzersiz bir gözetim davranışı enfeksiyon17,13,14. Son zamanlarda, başka bir γδ T hücre muhabiri fare geliştirilen (Tcrd-GDL) hangi sitoplazmada Gfp ifade tüm hücrenin görselleştirme izin18. Benzer metodoloji, özel kemokin reseptörlerinin gerekliliğini araştırmak için kullanılmıştır, örneğin G protein-bağlantılı reseptör (GPCR)-18 ve-55, IEL motilitesi19,20dinamikleri üzerinde. Hücreye özgü bir muhabir yokluğunda, CD8α karşı Floresan konjuite antikorları görselleştirmek ve iz hareket için kullanıldı19,20. Iki-foton lazer tarama mikroskobu yaygın intravital görüntüleme için kullanılan rağmen, Spinning disk konfeti lazer mikroskopinin kullanımı minimal arka plan gürültüsü ile yüksek hız ve yüksek çözünürlüklü çok kanallı görüntüleri yakalamak için benzersiz avantajlar sağlar. Bu teknoloji, bağırsak mukozasının kompleks mikroortamında bağışıklık/epitelyal etkileşimlerin uzamsal dinamiklerini hafifletmek için idealdir. Dahası, çeşitli transjenik ve/veya nakavt fare modellerinin kullanımı sayesinde, bu çalışmalar bağırsak immün ve/veya epitelyal hücre fonksiyonunun moleküler düzenlemesine ilişkin bilgi sağlayabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm dish, No. 1.5 Coverslip</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 Hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27g</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin Syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50822501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enclosed incubation chamber</td>
			<td>OKOLAB</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7983-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>55037C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted DMi8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IQ3 (v. 3.6.3)</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Putney</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas scissors 3&#8221; (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0798934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Forceps 4.25&#8221; (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td></td>
			<td>Lubricating Eye Ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of intraepithelial lymphocytes in murine small intestine

İntraepitelyal lenfositler γδ T hücre reseptörü (γδ ITO) intestinal epitelin bağışıklık gözetiminde önemli bir rol oynamaktadır. Γδ T hücre reseptörü için kesin bir ligand eksikliği kısmen nedeniyle, γδ IEL aktivasyonu ve fonksiyonları in vivo düzenlenmesi bizim anlayış sınırlı kalır. Bu, γδ IEL fonksiyonunun düzenlenmesi ve bu hücrelerin yerel mikroortama yanıt vermesiyle ilgili sinyalizasyon yollarını sorgulamak için Alternatif stratejilerin gelişmesini gerektirir. Γδ IELS, patojen translocation sınırlamak için yaygın olarak anlaşılabilse de, intravital görüntüleme kullanımı istikrarlı devlet ve invaziv patojenlere yanıt olarak IEL/epitelyal etkileşimlerin uzayotemporal dinamiklerini anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu belgede, ters dönen disk konfoksal lazer mikroskobu kullanarak bir GFP γδ T hücreli muhabir Mouse 'un küçük bağırsak mukozasında IEL göç davranışlarını görselleştirmede bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın maksimum görüntüleme derinliği iki foton lazer tarama mikroskopinin kullanımına göre sınırlı olsa da, Spinning disk konfoderi lazer mikroskobu, yüksek hızda görüntü edinimi ile azaltılmış fotokleaching ve fotohasar. 4D görüntü analiz yazılımını kullanarak, T hücresi gözetim davranışı ve komşu hücrelerle etkileşimleri, bağırsak mukozası içinde IEL aktivasyonu ve fonksiyonu konusunda ek bilgi sağlamak için deneysel manipülasyon aşağıdaki analiz edilebilir.

TcrdEGFP muhabiri fareler intravital görüntüleme kullanarak, daha önce bu γδ IELs bir dinamik gözetim davranışı, hangi onlar Bodrum membranı boyunca göç ve lateral hücre içi boşluk (LIS) içine sabit olarak epitelyum devriye sergiler göstermiştir (Şekil 2, Film 1).
Bu yaklaşım, belirli hücre sinyalizasyon yollarının ve/veya reseptörlerin inhibisyonu γδ IOL göç davranışını nasıl etkilediğini değerlendirmek için ...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine at JoVE.com

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

İntravital mikroskopi ince bağırsak mukozası farklı bağışıklık hücresi tipleri arasında epitel içinde hücresel etkileşimlerin spatiotemporal dinamikleri içine fikir sağlayabilir, ya da bu iki bölme arasında. Bu tekniğin en büyük avantajı, bağırsak mukozası içinde yüksek hızlı ve yüksek çözünürlüklü görüntülerin gerçek zamanlı olarak elde edilmesine olanak sağlamasıdır. Bağırsak canlı görüntüleme hücresel etkileşimleri içine ek fikir sağlayabilir, veya hücre sinyalmukozal bağışıklık dahil, epitel biyoloji veya kanser biyolojisi.Bu, cerrahi tekniğin uygulanmasının yanı sıra görüntü edinimi için farenin sabır ve optimum konumlandırılmasını gerektiren zorlu bir yöntemdir. Bir anestezi transgenik fare ayak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, gelişmiş bir yeşil floresan protein ifade, veya EGFP, Gamma-delta T-hücre reseptörü, yavaş yavaş retro-orbital venöz sinüs içine taze hazırlanmış Hoechst 33342 Boya Çözeltisi 200 mikrolitre enjekte etmek için bir tüberkülin şırınga kullanın. Enjeksiyondan 1-2 dakika sonra, kurumasını önlemek için hayvanın gözlerine merhem uygulayın.Daha sonra, alt karın orta hattı boyunca deri ve periton yoluyla 2CM dikey kesi yapmak ve dikkatle periton boşluğundan caecum çekmek için açılı forceps kullanın. Minimal dışkı içeriği içeren ince bağırsağın 2-3CM alanını belirleyin, mezenterik kan damarlarını yırtmamaya özen gösterdiniz ve kaecum ve kalan ince bağırsağı periton boşluğuna dikkatlice geri getirin ve ilgi segmentini dışsallaştırın. Altı çizili mezenterin her iki tarafına iki çift forceps yerleştirerek, hafifçe birlikte membran bir delik oluşturmak için forceps uçlarını ovmak.Açılı çalgılar ve 5CM dikiş bağlı kavisli konik nokta iğne kullanarak, membran deliğinden periton bir tarafı nüfuz, ve periton astar diğer tarafında üzerinden yukarı, üst bir dikiş yerleştirerek, ve kesi kapatmak için kesi altına yakın başka, bağırsak dışsal döngü tutarken. Başarı olasılığını artırmak için, abdominal dikiş yerleştirerek herhangi bir kan damarını kravat veya gözyaşı yok ve bağırsak herhangi bir yabancı kullanımı sınırlamak. Daha sonra, aynı şekilde bağırsak döngü altında deri kapatın, altı çizili periton önceki dikişler arasında kesi ortasında bir dikiş yerleştirerek.Bir elektrokoter kullanarak, antimesenteric sınır boyunca perforasyon bir çizgi yapmak ve hemen ek ısı kaynaklı doku hasarı önlemek için bağırsak yüzeyine su birkaç damla uygulayın. Artık suyu çıkarmak için kimwipe ile blot. Koterize dokunun distal kenarında yaklaşık 1,5 CM yatay yarık kesmek için vanna makas kullanın, koterize çizgi uzunluğu boyunca, dışsal doku segmentinin proksimal sonuna doğru.Mukozal yüzey maruz kaldığında, doku sulu tutmak için nemli bir kimwipe ile karın kapağı. İplik Disk Konfokal Mikroskopi Görüntüleme için fareyi kapalı bir kaptaki mikroskoba taşıyın. Görüntüleme yazılımını başlatın ve mikroskobun başını geriye doğru yatırın ve 1 mikromolar pire Alexa Fluor boyası ve Hank'in Tamponlu Tuzlu Solüsyonu'nu cam kapağın kaymış dibine 150 mikrolitre ekleyin.Fareyi, açılan mukozal yüzeyin doğrudan kapak kaymasına temas edecektir. Önceden ısıtılmış bir kuluçka makinesinde fareyi ve yemeği görüntüleme aşamasına yerleştirin. Her lazer için Uyarma Yoğunluğunu ve Pozlama Süresini sırasıyla en fazla 10-15 miliwatt ve 120-150 milisaniye olarak ayarlayın ve Çerçeve Ortalamasını 2 olarak ayarlayın.Arka plan gürültüsünü azaltmak için Elektron Çarpankazancı işlevini açın ve piksel boyutunun doğru bir ölçümünü sağlamak için 63X Hedef Kalibrasyon'u seçin. 405 nanometre lazer ve 20X hava hedefi kullanarak, fark hareket veya sürüklenme eksikliği villi bir alan bulmak için çekirdekleri elle görselleştirmek, solunum nedeniyle artifreal hareket alanları kaçınarak, peristalsis veya kalp atışı. X-Y Scan kullanarak, ilgi alanının X-Y koordinatını kaydedin ve gliserol daldırma 63X hedefine geçin.Seçili alandaki villinin kararlı olduğunu doğrulamak için 405 nanometre kanalda 1 dakikaya kadar canlı görüntü elde edin ve villus ucunun hemen altındaki ortogonal düzlemi bulmak için odağı ayarlayın. Daha sonra villus uç epitelinin hemen altından başlayarak, 1,5 mikrometre basamak kullanarak çekirdekleri çözmek zor olana kadar yaklaşık 15-20 mikrometre aşağı villus'a kadar z-yığınları elde edin. Satın alma başladıktan 3-5 dakika sonra, görüntü istikrarı ve Gama-delta Intraepitelyal Hücre Hareketliliği onaylamak ve villi her alan için 30-60 dakika görüntüleri elde devam.Gamma-delta İntraepitelyal Lenfositler dinamik bir gözetim davranışı sergilerler, bu davranışta, epifite, bodrum zarı boyunca göç ederek ve çalışma durumundalateral hücreler arası uzaya doğru devriye gezerler. Bu temsili görüntülerde, renkli izler 30 dakika boyunca bireysel Gama-delta Intraepitelyal Lenfositlerin göç yollarını gösterir. İntraepitelyal Lenfositlerin lateral hücreler arası alanda sıklığı anti-interlökin-2 reseptör beta antikorile tedavi edilen farelerde artmış olsa da, bu Gama-delta İntraepitelyal Lenfositlerin %30'dan fazlası rölanti davranışı sergilemiştir.Bu rölrede fenotip, kontrollere göre interlökin-2-reseptör blokoksiyonu takiben Gama-delta İntraepitelyal Lenfositlerin hem anlık hızında hem de hapsedilme oranında önemli bir azalma ile doğrulandı. Ayrıca, boştaki Gama-delta İntraepitelyal Lenfositler daha uzun süre lere sahipti ve daha sık lateral hücreler arası alan içinde lokalize edildi, hareketli Gamma-delta Intraepitelyal Lenfositler ile karşılaştırıldığında. Peristalsis nedeniyle aşırı hareket eksikliği villi alanları belirlemek zor olabilir.Fareyi yeniden konumlandırmak daha kararlı bir alanın bulunmasına yardımcı olabilir. Hücre izleme verilerinin daha fazla analizi, belirli hareketlilik davranışını belirlemeye veya hücresel etkileşimleri ölçmek için ek ölçümler sağlamaya yardımcı olabilir. İntravital Görüntüleme ve IEL-motilite analizi, doğuştan gelen immün sinyalin Gama-delta IEL işlevini nasıl düzenlediğine dair fikir veren, IEL fonksiyonunun standart bir okuma-out'u haline gelmiştir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em&gt; In Vivo</em&gt; PET / CT ile hücre Trafik

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...