Name: assessment of long-term depression induction in adult cerebellar slices
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices at JoVE.com

Nous remercions A. Oba pour son assistance technique. Cette recherche a été partiellement appuyée par Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 à K.Y.

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité RIKEN sur le soin et l'utilisation des animaux dans les expériences. Les souris ont été gardées dans les installations animales du RIKEN Center for Brain Science sous une température bien contrôlée (23-25 oC) et de l'humidité (45 % à 65 %) Conditions. Des souris mâles et femelles de WT (C57BL/6, 3-6 mois) ont été employées.
1. Préparation des solutions utilisées dans les expériences
<p class="jove_con...

<ol>
	<li>Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cerebellum as a Neuronal Machine. , (1967).</li><li>Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theory+of+cerebellar+cortex.">A theory of cerebellar cortex.</a> Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).</li><li>Albus, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+cerebellar+function.">Theory of cerebellar function.</a> Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).</li><li>Maekawa, K., Simpson, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+gain+control+of+vestibulo-ocular+reflex+by+the+cerebellum.">Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum.</a> Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).</li><li>Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+activity+during+motor+learning.">Purkinje cell activity during motor learning.</a> Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).</li><li>Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climbing+fibre+induced+depression+of+both+mossy+fibre+responsiveness+and+glutamate+sensitivity+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).</li><li>Ito, M., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+depression+of+parallel+fiber-Purkinje+cell+transmission+induced+by+conjunctive+stimulation+of+parallel+fibers+and+climbing+fibers+in+the+cerebellar+cortex.">Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex.</a> Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).</li><li>Ekerot, C. F., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+depression+of+parallel+fibre+synapses+following+stimulation+of+climbing+fibres.">Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres.</a> Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).</li><li>Sakurai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+modification+of+parallel+fibre-Purkinje+cell+transmission+in+in+vitro+guinea-pig+cerebellar+slices.">Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices.</a> Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).</li><li>Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depression+and+potentiation+of+the+synaptic+transmission+between+a+granule+cell+and+a+Purkinje+cell+in+rat+cerebellar+culture.">Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture.</a> Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).</li><li>Linden, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+depression+of+the+cerebellar+climbing+fiber-Purkinje+neuron+synapse.">Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse.</a> Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).</li><li>Safo, P., Regehr, W. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+vivo+mutations+of+the+AMPA+receptor+subunit+GluR2+and+its+interacting+protein+PICK1+eliminate+cerebellar+long-term+depression.">Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression.</a> Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).</li><li>Koekkoek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+FMR1+in+Purkinje+cells+enhances+parallel+fiber+LTD,+enlarges+spines,+and+attenuates+cerebellar+eyelid+conditioning+in+Fragile+X+syndrome.">Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome.</a> Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).</li><li>Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+long-term+depression+in+cerebellar+Purkinje+cells+in+mice+carrying+mutated+GluA2+C+terminus.">Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).</li><li>De Schutter, E., Bower, J. 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M., Bean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanisms+of+burst+firing+in+dissociated+Purkinje+neurons.">Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).</li><li>Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+cytoskeletal+filaments+selectively+reduces+Na+and+Ca+spikes+in+cultured+mammal+neurones.">Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones.</a> Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).</li><li>Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. 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C., Anchisi, D., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+current+mediated+by+metabotropic+glutamate+receptors+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).</li><li>Wang, S. S., Denk, W., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coincidence+detection+in+single+dendritic+spines+mediated+by+calcium+release.">Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release.</a> Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).</li><li>Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+signal+transduction+pathways+in+cerebellar+long-term+depression+by+kinetic+simulation.">Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cerebellar+engrams+in+short-term+and+long-term+motor+learning.">Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).</li><li>Inoshita, T., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+long-term+depression+in+the+cerebellar+flocculus+during+adaptation+of+optokinetic+response.">Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response.</a> eLife. 27, 36209 (2018).</li><li>Belmeguenai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+plasticity+complements+long-term+potentiation+in+parallel+fiber+input+gain+control+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).</li><li>Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SK2+channel+modulation+contributes+to+compartment+specific+dendritic+plasticity+in+cerebellar+Purkinje+cells.">SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 75, 108-120 (2012).</li></ol>

Différences entre les quatre protocoles
Dans les protocoles ltd-induisant 1 et 2, Cjs 300 fois à 1 Hz est suffisant pour induire le cervelateur LTD. La fréquence de stimulation des FC semblait être dans une gamme physiologique, parce que le taux de tir de pointe complexe chez les souris adultes alertes (P60) a été rapporté pour être 1.25 Hz36. Cependant, la stimulation des FC seule n'a pas causé de plasticité à long terme dans la synapse PF-CF, comme utilisé d...

L'organisation synaptique des réseaux neuronaux élaborés du cortex céréco-rebelle, composé de PC, d'interneurons de couche moléculaire (cellules de panier et de stellate), de cellules de Golgi, de PFdes des cellules granules, de fibres moussues et de fibres d'escalade (CFs), ont été élucidées en termes d'excitation/inhibition et de divergence/convergence, et le diagramme de circuits bien organisé a suggéré que le cervelet est une « machine neuronale »1,bien qu'il n'y ait aucune idée auparavant du but de cette « machine ». Plus tard Marr a proposé que l'entrée des PC aux PC constituent un réseau d'apprentissage associatif à trois couches2. Il a également suggéré que chaque FC transmette une instruction cérébrale pour le mouvement élémentaire2. Il a supposé que l'activation simultanée des PF set et des CF augmenterait l'activité de synapse de PF-PC, et causerait la potentialisation à long terme (LTP) de la synapse de PF-PC. D'autre part, Albus a supposé que l'activation synchrone des PF et des FC a entraîné l'ILD aux synapses PF-PC3. Les deux études ci-dessus interprètent le cervelet comme un dispositif de mémoire unique, dont l'incorporation dans le réseau cortical cérécolar conduit à la formation du modèle de machine d'apprentissage Marr-Albus.
Suivant ces prédictions théoriques, deux lignes de preuve suggèrent la présence de plasticité synaptique dans le cervelet. La première ligne de preuve a été suggérée par l'organisation anatomique du flocculus; ici les voies MF d'origine vestibulaire d'organe et les voies de CF d'origine rétinienne convergent sur les PC4. Ce modèle unique de convergence suggère qu'une plasticité synaptique se produisant dans le flocculus cause l'adaptabilité remarquable du réflexe vestibulo-oculaire. Deuxièmement, l'enregistrement de la réponse des PC dans le flocculus et le lésion du flocculus étayaient également l'hypothèse ci-dessus5,6,7. En outre, le modèle de décharge de PC pendant l'adaptation du mouvement de main d'un singe8 a soutenu l'hypothèse de plasticité synaptique, particulièrement Albus's LTD-hypothesis3.
Pour déterminer la nature de la plasticité synaptique directement, la stimulation conjonctive répétée (Cjs) d'un faisceau de PFets et le CF qui intériorise spécifiquement le PC in vivo a été montré pour induire LTD pour l'efficacité de transmission des synapses PF-PC9, 10,11. Dans les explorations in vitro suivantes utilisant une tranche de cervelateur12 et des PC cultivés, conjonction de la stimulation co-cultivée de cellules de granule et de stimulation de cellules d'olive13 ou conjonction du glutamate et somatique appliqués iontophoretically dépolarisation14,15 causé LTD. Le mécanisme de transduction de signal sous-jacent à l'induction LTD a également été intensivement étudié à l'aide de préparations in vitro16,17.
Les adaptations du VOR et de l'OKR ont souvent été utilisées pour l'évaluation quantitative des effets de manipulation des gènes sur l'apprentissage moteur céréreux, parce que le cortex vestibule-cérévelateur s'est avéré être l'origine essentielle de l'apprentissage adaptatif du VOR18 ,19,20 et l'OKR19,21 La corrélation entre l'échec de l'induction de LTD et l'affaiblissement de l'apprentissage moteur comportemental a été prise comme preuve que LTD joue un rôle essentiel dans le moteur mécanismes d'apprentissage22. Ces points de vue sont collectivement appelés l'hypothèse LTD de l'apprentissage moteur, ou Marr-Albus-Ito hypothèse23,24,25,26.
L'apprentissage adaptatif du mouvement des yeux a été mesuré à l'aide de protocoles similaires, tandis que diverses conditions expérimentales ont été utilisées pour induire ltd dans la préparation des tranches27,28,29,30,31 . Récemment, Schonewille et coll.26 ont signalé que certaines souris manipulées par des gènes ont démontré un apprentissage moteur normal, mais que les tranches de cérévelateur n'ont pas montré de LTD, et ont ainsi conclu que la Ltd n'était pas essentielle à l'apprentissage moteur. Cependant, l'induction de ltd n'a été tentée qu'en utilisant un type de protocole à température ambiante. Par conséquent, nous avons utilisé plusieurs types de protocoles ltd-induisant dans des conditions d'enregistrement à environ 30 oC, et nous avons confirmé que le LTD a été induit de façon fiable chez les souris manipulées par les gènes en utilisant ces protocoles à des températures physiologiques proches32.
Cependant, il reste quelques questions concernant les propriétés de base de la stimulation conjonctive. La première est la relation entre la forme de la pointe complexe et l'amplitude de LTD. Deuxièmement, en conjonction avec PF-stimulation et dépolarisation somatique, si le nombre de stimuli utilisés étaient nécessaires ou non était insaisissable. Dans la présente étude, ces questions ont été étudiées à l'aide de souris de type sauvage (WT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices-Axon</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices-Axon</td>
			<td>Digidata1322A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>ISOflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse E600FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>MP1 Single Channel Pump</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water maker</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MilliQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for experiment</td>
			<td>Molecular probe-Axon</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for statistics</td>
			<td>KyensLab</td>
			<td>KyPlot 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of long-term depression induction in adult cerebellar slices

La plasticité synaptique fournit un mécanisme d'apprentissage et de mémoire. Pour l'apprentissage moteur cérévelaire, la dépression à long terme (LTD) des transmissions synaptiques des fibres parallèles (PF) aux cellules de Purkinje (PC) est considérée la base pour l'apprentissage de moteur, et les insuffisances de LTD et d'apprentissage de moteur sont observées dans divers animaux manipulés par des gènes. Des ensembles communs d'apprentissage de moteur, tels que l'adaptation du réflexe optokinetic (OKR), le réflexe vestibulaire-oculaire (VOR), et l'essai de rotarod ont été employés pour l'évaluation de la capacité d'apprentissage de moteur. Cependant, les résultats obtenus à partir du termininus gluA2-carboxy modifié knock-in souris ont démontré l'adaptation normale du VOR et de l'OKR, en dépit de l'absence de PF-LTD. Dans ce rapport, l'induction de ltd a été essayée seulement utilisant un type de protocole de stimulation à la température ambiante. Ainsi, les conditions pour induire le LÉve de cervelateur ont été explorées dans les mêmes mutants knock-in utilisant divers protocoles à la température physiologique proche. Enfin, nous avons trouvé des protocoles de stimulation, par lesquels la LTD pourrait être induite chez ces souris manipulées par les gènes. Dans cette étude, un ensemble de protocoles sont proposés pour évaluer l'induction de LTD, qui permettra plus précisément l'examen de la relation causale entre LTD et l'apprentissage moteur. En conclusion, les conditions expérimentales sont cruciales lors de l'évaluation de la LTD chez les souris manipulées par des gènes.

Quatre protocoles ont été employés dans cette étude pour induire le CErebellar LTD. Dans les deux premiers protocoles (protocole 1 et 2), la conjonction de la stimulation PF et de la stimulation de la fibrose kystique a été appliquée dans des conditions de pince séminude. Dans les deux autres protocoles (protocole 3 et 4), la dépolarisation somatique a été remplacée par la stimulation de la fibrose kystique dans des conditions de tension-clamp. Des traces de tension ou de courant-traces pendant la stimulation...

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Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Chez certains animaux manipulés par des gènes, l'utilisation d'un seul protocole peut ne pas induire la Ltd dans les cellules cérévelaires de Purkinje, et il peut y avoir un écart entre la LTD et l'apprentissage moteur. Plusieurs protocoles sont nécessaires pour évaluer l'induction de LTD chez les animaux manipulés par des gènes. Les protocoles standard sont affichés.

Évaluation de l'induction à long terme de dépression dans les tranches de cérévelateur adultes

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Lorsqu’une fonction protéique particulière est modifiée par manipulation génétique, la coordination de l’échec irritant et de l’affaiblissement de fonctionnement moteur est considérée comme une condition nécessaire à la relation causale entre l’ILD et l’apprentissage moteur. Ici, nous démontrons l’utilisation de protocoles multiples pour évaluer ltd qui peuvent être induits par des mécanismes compensatoires chez les animaux manipulés par les gènes. Avant de récolter le cerveau, réfrigérer et oxygéner deux beakers de 50 millilitres d’ACSF sur la glace.Lorsque la température de la solution atteint moins de quatre degrés Celsius, ajouter 50 microlitres d’une tétrodotoxine millimolaire à l’un des beakers glacés. Pour récolter le cerveau, tenez la tête et utilisez des ciseaux ophtalmologiques pour couper la peau superficielle le long de la ligne médiane. Rétractez manuellement la peau pour exposer largement la surface du crâne et utilisez les ciseaux pour couper le long du crâne horizontalement du trou spinocerebellar majeur à juste au-dessus des yeux et des oreilles avant de couper le crâne le long d’une ligne au-dessus des deux yeux.Utilisez un scalpel pour couper le cerveau au milieu du cerveau et isoler la partie caudale du cerveau, y compris le cervelet, du crâne. Immerger l’échantillon dans le bécher glacé de l’ACSF et ajuster le tube à bulles de sorte qu’il ne remue pas le bloc cérébral dans le bécher. Après au moins sept minutes, utiliser une spatule pour ramasser le bloc cérébral et utiliser un morceau de papier filtre pour absorber tout excès d’ACSF.Monter le côté ventral tissu vers le bas sur un morceau de deux par deux centimètres d’agar avec un adhésif médical approprié. Utilisez une lame pour découper l’hémisphère droit du tissu cérébral aussi parallèle que possible au plan dendritique des cellules de Purkinje. Couper et enlever l’autre côté de l’hémisphère et couper le cerveau entre le colliculi supérieur et inférieur.Couper la moelle épinière et coller le côté droit du cervelet paré avec le bloc d’agar sur le plateau de spécimens pré-réfrigérés. Ensuite, en inclinant le plateau de spécimens, versez l’ACSF sur l’échantillon pour fixer le tissu et pour laver tout excès de colle. Pour trancher l’échantillon de cerveau, orientez le spécimen de telle sorte que le côté dorsal du cervelet soit à l’avant et versez assez de l’ACSF de coupe froide de glace complété avec la tetrodotoxine pour immerger complètement le cervelet.Placez un tube à gaz dans la solution de coupe et lancez le bouillonnement avec un mélange oxygène-dioxyde de carbone. À l’aide de pinces fines et de loupes, retirer la mater arachnoïdide et exciser le pédontcle cerebellar. Après avoir enlevé le tronc cérébral et le bloc d’agar, faites pivoter le plateau à 180 degrés de sorte que la surface dorsale du cervelet fait face à la lame de rasoir du vibratome et ajustez le premier endroit de coupe.Réglez l’amplitude vibratoire à 5,5 et la fréquence à 85 Hertz, la vitesse à trois à quatre, et l’épaisseur de la tranche à 300 micromètres. Au fur et à mesure que les tranches de cerebellar sont obtenues, utilisez un filet de nylon pour transférer les sections dans un incubateur acrylique dans un bain d’eau de 26 degrés Celsius et immerger complètement les échantillons dans l’ACSF fraîchement oxygéné pendant au moins une heure. Pour le rapport de pince de correction de cellules entières, dissoudre une picrotoxine micromolaire dans ACSF par ultasonication pendant trois minutes avant de perfuser une chambre d’enregistrement de 30 degrés Celsius avec la solution de toxine à un taux d’écoulement de deux millilitres par minute.Après quelques minutes, transférer une tranche de cerebellar dans la chambre d’enregistrement et fixer le tissu avec un poids platine et des fils de nylon. Remplissez ensuite une électrode stimulante d’ACSF frais. Pour stimuler les fibres parallèles, placez l’électrode stimulante à la surface de la couche moléculaire à environ 50 micromètres de la couche cellulaire de Purkinje.Pour la stimulation des fibres grimpantes, placez l’électrode stimulante au bas de la couche cellulaire de Purkinje et utilisez un microchargeur pour remplir une électrode d’enregistrement de huit microlitres de solution interne filtrée au potassium ou au césium de 0,45 micromètre. Appliquez une faible pression positive sur l’électrode d’enregistrement avant d’immerger l’électrode dans l’ACSF. La résistance aux électrodes doit être de deux à quatre mégaohms et le potentiel de jonction liquide doit être corrigé.Approchez le corps sain de cellules brillantes d’une cellule Purkinje avec l’électrode d’enregistrement et poussez légèrement la surface de la cellule de Purkinje. Ensuite, arrêtez d’appliquer la pression positive et appliquez une pression négative jusqu’à formation d’un joint gigaohm. Ensuite, utilisez une pression négative pour établir une configuration cellulaire entière, en maintenant le potentiel de la membrane à moins 70 millivolts et en appliquant un moins deux millivolt 100 millisecondes impulsions à 0,1 hertz, surveillance continue de la résistance aux entrées, résistance en série, et la capacité d’entrée.Pour l’induction à long terme de dépression, stimulez la couche moléculaire avec une impulsion de 0.1 milliseconde et appliquez un stimulus double d’impulsion pour identifier les courants post-synaptiques excitatoires parallèles de fibre. Une facilitation appariée d’impulsion et une augmentation graduelle de l’amplitude par rapport à l’augmentation de l’intensité de stimulation devraient être observées. Pour enregistrer la réponse au test, appliquez une seule impulsion hertzique de 0,1 et ajustez l’intensité du stimulus de sorte que l’amplitude évoquée soit d’environ 200 picoamps.Stimuler les fibres grimpantes au bas de la couche cellulaire Purkinje et d’identifier les courants post-synaptiques excitatifs de fibre parallèles obtenus par l’activation de la fibre grimpante, appliquer un stimulus double impulsion. Une dépression pulsée appariée doit être observée d’une manière tout ou aucune en corrélation avec l’augmentation de l’intensité de la stimulation. Dans cette expérience représentative, une conjonction d’une stimulation parallèle de fibre et d’une stimulation de fibre d’escalade dans les conditions actuelles de pince ont été employées pour la préparation de tranche.La forme de la pointe complexe obtenue par la stimulation conjonctive était semblable à celle obtenue par la stimulation de fibre grimpant seule avec le premier spikelet raide suivi de deux à trois pointes. Un pic complexe de forme similaire a été observé quand une stimulation parallèle de fibre a été suivie 50 millisecondes plus tard par un deuxième parallèle conjonctif et une stimulation de fibre d’escalade. Dans cet essai dans des conditions de pince de tension utilisant une solution interne césium-basée, une stimulation parallèle de fibre a été suivie 50 millisecondes plus tard par une application concomitante d’une deuxième stimulation parallèle de fibre et de la dépolarisation somatique.Un courant intérieur a été obtenu lors de la dépolarisation somatique de moins 70 à zéro millivolts et le courant de queue a également été évoqué après la repolarisation. Enfin, cinq stimulus parallèles de fibre à 100 hertz ont été donnés simultanément avec la dépolarisation somatique dans des conditions de pince de tension. Encore une fois, une génération répétitive de courants intérieurs a été obtenue pendant la dépolarisation et le courant de queue a été induit après la repolarisation.Pour évaluer la relation entre le cerebellar LTD et l’apprentissage moteur chez les animaux manipulés par les gènes, de multiples protocoles devraient être utilisés pour induire l’LTD dans des conditions physiologiques confortables. Si cerebellar LTD est visualisé chez les animaux manipulés par gène après l’apprentissage moteur, la relation causale entre eux peut être examinée plus directement.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

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Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Recherche

Neurosciences

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Amélioration de la préparation et la conservation de l&#39;hippocampe Tranches de souris pour un enregistrement très stable et reproductible de potentialisation à long terme

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

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À long terme de suivi comportemental de librement piscine faiblement poisson électrique

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

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Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

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Génération et entretien à long terme sans nerve<em&gt; Hydra</em

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Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...