Name: assessment of long-term depression induction in adult cerebellar slices
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00
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A. Oba의 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 과학 연구를위한 보조금에 의해 지원되었다 (C) K.Y에 17K01982.

모든 실험 절차는 실험에서 동물의 관리 및 사용에 대한 RIKEN 위원회의 승인을 받았습니다. 마우스는 잘 제어 된 온도 (23-25 ° C)와 습도 (45 %-65 %)에서 뇌 과학RIKEN 센터의 동물 시설에 보관되었다 조건. 남성과 여성 WT 마우스 둘 다 사용 (C57BL/6, 3-6 개월) 사용 되었다.
1. 실험에 사용되는 솔루션준비
참고: 모든 용액은 금속 (저항 > 18.2 MΩ) 및 기타 ?...

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P., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SK2+channel+modulation+contributes+to+compartment+specific+dendritic+plasticity+in+cerebellar+Purkinje+cells.">SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 75, 108-120 (2012).</li></ol>

네 가지 프로토콜 간의 차이점
LTD-유도 프로토콜 1 및 2에서, CJs 300번 은 1Hz에서 소뇌 를 유도하기에충분하다. 그러나, CF 자극 만으로는 프로토콜 1 및 2에서 사용되는 바와 같이 PF-CF 시냅스에서 장기적인 가소성을 일으키지않았으며(도 4, 도 5),CF 자극 이 고주파에서 단독으로 유도된 LTD24. 프로토콜...

PC, 분자층 인터뉴런(바구니 및 스텔레이트 세포), 골지 세포, 과립 세포로부터의 PF, 이끼 섬유 및 등반 섬유(CFs)로 구성된 소뇌 피질의 정교한 뉴런 네트워크의 시냅스 조직이 해명되었습니다. 여기 / 억제 및 발산 / 수렴의 관점에서, 잘 조직 된 회로 도면은 소뇌가 "신경기계"1이라고제안했지만 이전에는이 "기계"의 목적에 대해 전혀 알지 못했습니다. 나중에 Marr는 PC에 대한 PFs 입력이 삼중 층 연관 학습 네트워크2를구성할 것을 제안했다. 그는 또한 각 CF원소 운동에 대한 대뇌 지시를 전달하는 것이 좋습니다2. 그는 PF와 CF의 동시 활성화가 PF-PC 시냅스 활성을 향상시키고, PF-PC 시냅스의 장기 적인 강력성(LTP)을 유발할 것이라고 가정했습니다. 한편, Albus는 PF와 CF의 동기 활성화가 PF-PC 시냅스3에서LTD를 초래했다고 가정했습니다. 위의 두 연구는 소뇌를 독특한 메모리 장치로 해석하며, 소뇌 피질 네트워크에 통합하면 Marr-Albus 모델 학습 기계 모델의 형성으로 이어집니다.
이러한 이론적 예측에 따라, 증거의 두 줄은 소뇌에 시 냅 스가 소의 존재를 제안. 증거의 첫 번째 줄은 flocculus의 해부학 조직에 의해 제안되었다; 여기에 전정 기관 기원의 MF 경로와 망막 기원의 CF 경로는 PC에 수렴4. 이 독특한 수렴 패턴은 응고에서 발생하는 시냅스 가소성이 현관 -안구 반사의 현저한 적응성을 유발한다는 것을 시사합니다. 둘째, 상기 가설5,6,7을지지한 부두및 플류쿠스의 병변에서의 PC 반응의 기록도 뒷받침한다. 더욱이, 원숭이의 손 운동 8의 적응 시 PC 방전패턴은 시냅스 가설, 특히 알버스의 LTD 가설3을 지지했다.
시냅스 가소성의 성질을 직접 확인하기 위해, PC를 생체 내에서 특이적으로 조절하는 PF및 CF의 번들의 반복적인 결막 자극(Cjs)은 PF-PC 시냅스의 투과 효능에 대한 LTD를 유도하는 것으로 나타났다9, 10,11. 후속 시험관내 탐사에서 소뇌 슬라이스12 및 배양된 PC를 사용하여, 공동 배양된 과립 세포 자극 및 올리브 세포자극(13) 또는 이온토포리스트 및 체세포의 결합 탈분극14,15 는 LTD. LTD-유도의 기초가 되는 신호 환전 메커니즘도 시험관내 제제16,17을사용하여 집중적으로 조사되었다.
VOR 및 OKR의 적응은 종종 소뇌 운동 학습에 대한 유전자 조작 효과의 정량적 평가에 사용되었으며, 이는 현관-소뇌 피질이 VOR18의 적응 학습에서 필수적인 기원인 것으로 입증되었기 때문입니다. ,19,20 및 OKR19,21 LTD 유도 실패와 행동 모터 학습장애 사이의 상관관계는 LTD가 모터에서 필수적인 역할을 한다는 증거로 간주되었습니다. 학습 메커니즘22. 이러한 견해는 총칭하여 모터 학습의 LTD 가설, 또는 Marr-Albus-Ito 가설23,24,25,26으로지칭된다.
눈 운동의 적응 학습은 유사한 프로토콜을 사용하여 측정되었으며, 다양한 실험 조건은 슬라이스 준비27,28,29,30,31에서 LTD를 유도하는 데 사용되었습니다. . 최근 Schonewille 등26 일부 유전자 조작 마우스는 정상적인 운동 학습을 입증했지만 소뇌 조각은 LTD를 보여주지 않았으며, 따라서 LTD가 모터 학습에 필수적이지 않다는 결론을 내렸습니다. 그러나, LTD의 유도는 실온에서 한 가지 유형의 프로토콜만을 사용하여 시도되었다. 따라서, 우리는 약 30 °C에서 기록 조건 하에서 LTD 유도 프로토콜의 여러 유형을 사용하고, 우리는 LTD가 거의 생리적 온도32에서이러한 프로토콜을 사용하여 유전자 조작 마우스에서 안정적으로 유도되었다는 것을 확인하였다.
그러나, 결막 자극의 기본 속성에 관한 몇 가지 질문이 남아있다. 첫 번째는 복잡한 스파이크의 모양과 LTD의 진폭 간의 관계입니다. 둘째, PF-자극 및 체세포 탈분극과 함께, 사용된 자극의 수가 필요한지 아닌지는 모호했다. 본 연구에서, 이들 질문은 야생형(WT) 마우스를 사용하여 조사하였다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices-Axon</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices-Axon</td>
			<td>Digidata1322A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>ISOflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse E600FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>MP1 Single Channel Pump</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water maker</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MilliQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for experiment</td>
			<td>Molecular probe-Axon</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for statistics</td>
			<td>KyensLab</td>
			<td>KyPlot 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of long-term depression induction in adult cerebellar slices

시냅스 가소성은 학습과 기억을 위한 메커니즘을 제공합니다. 소뇌 운동 학습의 경우, 병렬 섬유 (PF)에서 Purkinje 세포 (PC)에 시냅스 전송의 장기 우울증 (LTD)는 모터 학습의 기초로 간주되며, LTD 및 모터 학습모두의 결핍은 다양한 에서 관찰된다 유전자 조작 동물. 안구 반사(OKR), 전두환-안구 반사(VOR) 및 회전 시험의 적응과 같은 일반적인 운동 학습 세트는 운동 학습 능력의 평가에 사용되었다. 그러나, GluA2-카르복시 종단 변형 마우스로부터 얻은 결과는 PF-LTD가 부족함에도 불구하고 VOR 및 OKR의 정상적인 적응을 입증하였다. 이 보고서에서, LTD의 유도는 실온에서 한 가지 유형의 자극 프로토콜을 사용하여 시도되었다. 따라서, 소뇌 를 유도하는 조건은 거의 생리적 온도에서 다양한 프로토콜을 사용하여 동일한 노크인 돌연변이체에서 탐구되었다. 마지막으로, 우리는 LTD가 이 유전자 조작마우스에서 유도될 수 있는 자극 프로토콜을 발견했습니다. 이 연구에서는 LTD-유도를 평가하기 위해 일련의 프로토콜이 제안되어 LTD와 모터 학습 사이의 인과 관계를 보다 정확하게 검사할 수 있습니다. 결론적으로, 실험 조건은 유전자 조작 마우스에서 LTD를 평가할 때 결정적이다.

4개의 프로토콜은 소뇌 LTD를 유도하기 위하여 이 연구 결과에서 이용되었다. 처음 두 프로토콜(프로토콜 1 및 2)에서, PF-자극 및 CF-자극의 결합은 전류 클램프 조건 하에서 적용되었다. 다른 두 프로토콜(프로토콜 3 및 4)에서, 체세포 탈분극은 전압 클램프 조건하에서 CF 자극을 대체하였다. 결막 자극 동안의 전압 트레이스 또는 전류 트레이스를비교하였다(도 2).
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Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

일부 유전자 조작 동물에서, 단일 프로토콜을 사용하여 소뇌 Purkinje 세포에서 LTD를 유도하는 데 실패할 수 있으며, LTD와 모터 학습 사이에 불일치가 있을 수 있다. 유전자 조작 동물에서 LTD 유도를 평가하기 위해 여러 프로토콜이 필요합니다. 표준 프로토콜이 표시됩니다.

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

특정 단백질 기능이 유전자 조작에 의해 변형될 때, 자극실패및 운동 실행 장애의 조정은 LTD와 모터 학습 사이 인과 관계에 필요한 조건으로 간주됩니다. 여기서 우리는 유전자 조작 된 동물의 보상 메커니즘을 통해 유도 될 수있는 LTD를 평가하기 위해 여러 프로토콜의 사용을 보여줍니다. 뇌를 수확하기 전에 얼음 위에 ACSF의 50 밀리리터 비커 두 개를 차갑게 하고 산소를 공급합니다.용액 온도가 섭씨 4도 이하로 도달하면 얼음 차가운 비커 중 하나에 1 밀리머 테트로독신 50 마이크로리터를 추가하십시오. 뇌를 수확하려면 머리를 잡고 안과 가위를 사용하여 중간선을 따라 피상적 인 피부를 자른다. 수동으로 두개골 표면을 노출하고 가위를 사용하여 주요 척추 내뇌 구멍에서 눈과 귀 바로 위에 두개골을 수평으로 자르는 후 양쪽 눈 위의 선을 따라 두개골을 절단합니다.메스를 사용하여 뇌의 중간에 있는 뇌를 자르고 두개골에서 소뇌를 포함한 뇌의 소달 부분을 분리합니다. ACSF의 얼음 차가운 비커에 샘플을 담그고 비커의 뇌 블록을 교반하지 않도록 거품 튜브를 조정합니다. 적어도 7 분 후, 뇌 블록을 선택하고 여분의 ACSF를 흡수하기 위해 필터 종이의 조각을 사용하는 주걱을 사용합니다.적절한 의료 접착제와 천의 2 센티미터 조각에 조직 복부 측면을 아래로 마운트. 블레이드를 사용하여 Purkinje 세포의 수지상 평면과 가능한 한 병렬로 뇌 조직의 오른쪽 반구를 잘라냅니다. 반구의 다른 쪽을 잘라내고 제거하고 우수한 콜리큘리 사이의 뇌를 잘라냅니다.척수를 잘라 미리 차가운 표본 트레이에 천막 블록으로 손질 된 소뇌의 오른쪽을 접착제. 그런 다음, 표본 트레이를 기울이고, 조직을 고치고 여분의 접착제를 씻어 샘플에 ACSF를 부어. 뇌 샘플을 슬라이스하기 위해, 소뇌의 등쪽측이 전면에 있고 테트로독신으로 보충된 얼음 냉간 절단 ACSF를 충분히 부어 소뇌에 완전히 침지하도록 시편을 지향한다.가스관을 절삭 액에 넣고 산소 이산화탄소 가스 혼합물로 버블링을 시작합니다. 미세 핀셋과 돋보기를 사용하여 거미 류를 제거하고 소뇌 페달을 제거합니다. 뇌간과 천 블록을 제거한 후, 소뇌의 등쪽 표면이 진동의 면도날을 마주하고 첫 번째 절단 위치를 조절하도록 트레이180도 회전한다.진동진폭을 5.5로 설정하고 주파수를 85 헤르츠로, 속도는 3~4로, 슬라이스 두께를 300 마이크로미터로 설정합니다. 소뇌 슬라이스가 얻어지므로 나일론 그물을 사용하여 26도 의 수조에서 아크릴 인큐베이터로 섹션을 옮기고 적어도 한 시간 동안 신선한 산소 ACSF에 샘플을 완전히 담급니다. 전체 세포 패치 클램프 보고의 경우, 분당 2밀리리터의 독소 용액으로 섭씨 30도 기록 챔버를 인퓨전하기 전에 3분 동안 ACSF에 마이크로몰라 피크로톡신 1개를 용해한다.몇 분 후, 소뇌 조각을 기록 챔버로 옮기고 백금 무게와 나일론 실로 조직을 고정시십시오. 그런 다음 자극하는 전극을 신선한 ACSF로 채웁니다. 병렬 섬유를 자극하기 위해, Purkinje 세포 층에서 약 50 마이크로미터분자 층의 표면에 자극 전극을 배치합니다.등반 섬유의 자극을 위해, 자극 전극을 Purkinje 세포 층의 바닥에 놓고 마이크로 로더를 사용하여 0.45 마이크로 미터 여과 칼륨 또는 세슘 기반의 내부 용액의 8 개의 마이크로 리터로 기록 전극을 채웁니다. ACSF에 전극을 침지하기 전에 기록 전극에 약한 양압을 가하십시오. 전극 저항은 2~4메가옴이어야 하며 액체 접합 전위도 를 수정해야 합니다.기록 전극으로 Purkinje 세포의 건강한 밝은 세포 체체에 접근하고 Purkinje 세포의 표면을 약간 밀어 넣습니다. 그런 다음 양압을 바르는 것을 멈추고 기가움 씰이 형성될 때까지 음압을 가하십시오. 그런 다음 음성 압력을 사용하여 전체 셀 구성을 확립하고, 영하 70밀리볼트에서 멤브레인 전위를 유지하고 0.1 헤르츠에서 마이너스 2 밀리볼트 100 밀리초 펄스를 적용하고 입력 저항, 시리즈 저항 및 입력 커패시턴스를 지속적으로 모니터링합니다.장기 우울증 유도의 경우 0.1 밀리초 펄스로 분자 층을 자극하고 이중 펄스 자극을 적용하여 병렬 섬유 흥분 성 후 시냅스 전류를 식별합니다. 자극 강도의 증가에 비해 쌍이 결합된 펄스 촉진 및 진폭의 점진적 증가를 관찰해야 한다. 시험 반응을 기록하려면, 단일 0.1 헤르츠 펄스를 적용하고 자극의 강도를 조정하여 방출진환이 약 200 피코앰프입니다.Purkinje 세포 층의 바닥에 등반 섬유를 자극하고 등반 섬유 활성화에 의해 유도 된 병렬 섬유 흥분 후 전류를 식별하기 위해, 이중 펄스 자극을 적용합니다. 쌍이 있는 펄스 불경기는 자극 강도의 증가와 상관관계에 있는 전부 또는 없음 방식으로 관찰되어야 합니다. 본 대표적인 실험에서는, 현재 클램프 조건 하에서 하나의 병렬 섬유 자극과 하나의 등반 섬유 자극의 결합이 슬라이스 제제에 사용되었다.결막 자극에 의해 유도된 복잡한 스파이크의 형상은 첫 번째 가파른 스파이크렛을 가진 것만으로 등반 섬유 자극에 의해 유도된 것과 유사했으며, 그 다음으로 2~3개의 스파이크릿이 뒤따랐다. 유사하게 형성된 복잡한 스파이크는 결막 제2 병렬 및 등반 섬유 자극에 의해 50밀리초 후에 하나의 병렬 섬유 자극을 따를 때 관찰되었다. 세슘 기반 내부 용액을 이용한 전압 클램프 조건 하에서 이 테스트에서, 두 번째 병렬 섬유 자극 및 체질 탈극화를 수반하여 50밀리초 후에 병렬 섬유 자극을 수행하였다.내전류는 영하 70에서 0 밀리볼트로 체세포 탈극화를 유도하고 꼬리 전류도 변각화 후 연상되었다. 마지막으로, 100 헤르츠에서 5개의 병렬 섬유 자극을 전압 클램프 조건하에서 체세포 탈극화와 동시에 투여하였다. 다시 말하지만, 탈극화 중에 내류의 반복적인 생성이 유도되었고, 꼬리 전류는 재분화 후 유도되었다.유전자 조작 된 동물에서 소뇌 LTD와 모터 학습 사이의 관계를 평가하기 위해, 여러 프로토콜은 아늑한 생리 조건하에서 LTD를 유도하는 데 사용되어야한다. 소뇌 LTD가 모터 학습 후 유전자 조작 된 동물에서 시각화되는 경우, 그들 사이의 인과 관계는 더 직접적으로 조사 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

연구

신경과학

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

신경이없는 세대의 장기간 유지 관리<em&gt; 히드라</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

자유롭게 행동 하는 쥐에 장기 감각 충돌

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...