Name: assessment of long-term depression induction in adult cerebellar slices
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices at JoVE.com

Agradecemos A A. Oba por sua assistência técnica. Esta pesquisa foi parcialmente apoiada por Grant-in-Aid para pesquisa científica (C) 17K01982 para KY

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê RIKEN sobre o cuidado e uso de animais em experimentos. Os camundongos foram mantidos na instalação animal do centro de RIKEN para a ciência do cérebro temperatura bem controlada (23 – 25 ° c) e umidade (45% – 65%) Condições. Foram utilizados camundongos do peso masculino e feminino (C57BL/6, 3 – 6 meses).
1. preparação de soluções utilizadas nos experimentos
Nota: Toda...

<ol>
	<li>Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cerebellum as a Neuronal Machine. , (1967).</li><li>Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theory+of+cerebellar+cortex.">A theory of cerebellar cortex.</a> Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).</li><li>Albus, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+cerebellar+function.">Theory of cerebellar function.</a> Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).</li><li>Maekawa, K., Simpson, J. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+activity+during+motor+learning.">Purkinje cell activity during motor learning.</a> Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).</li><li>Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climbing+fibre+induced+depression+of+both+mossy+fibre+responsiveness+and+glutamate+sensitivity+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).</li><li>Ito, M., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+depression+of+parallel+fiber-Purkinje+cell+transmission+induced+by+conjunctive+stimulation+of+parallel+fibers+and+climbing+fibers+in+the+cerebellar+cortex.">Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex.</a> Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).</li><li>Ekerot, C. F., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+depression+of+parallel+fibre+synapses+following+stimulation+of+climbing+fibres.">Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres.</a> Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).</li><li>Sakurai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+modification+of+parallel+fibre-Purkinje+cell+transmission+in+in+vitro+guinea-pig+cerebellar+slices.">Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices.</a> Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).</li><li>Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depression+and+potentiation+of+the+synaptic+transmission+between+a+granule+cell+and+a+Purkinje+cell+in+rat+cerebellar+culture.">Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture.</a> Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).</li><li>Linden, D. 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J., Miyashita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+effects+of+unilateral+lesions+in+the+flocculus+upon+eye+movements+in+albino+rabbits.">Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits.</a> Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).</li><li>Nagao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+vestibulocerebellar+lesion+upon+dynamic+characteristics+and+adaptation+of+vestibulo-ocular+and+optokinetic+responses+in+pigmented+rabbits.">Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits.</a> Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).</li><li>Watanabe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+events+correlated+with+long-term+adaptation+of+the+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+in+the+primate+flocculus.">Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus.</a> Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).</li><li>van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABAergic+and+noradrenergic+injections+into+the+cerebellar+flocculus+on+vestibulo-ocular+reflexes+in+the+rabbit.">Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit.</a> Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).</li><li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+motor+learning+in+the+cerebellum.">Mechanism of motor learning in the cerebellum.</a> Brain Research. 886, 237-245 (2000).</li><li>De Schutter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+long-term+depression+might+normalize+excitation+of+Purkinje+cells:+a+hypothesis.">Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis.</a> Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).</li><li>Hansel, C., Linden, D. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+FMR1+in+Purkinje+cells+enhances+parallel+fiber+LTD,+enlarges+spines,+and+attenuates+cerebellar+eyelid+conditioning+in+Fragile+X+syndrome.">Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome.</a> Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).</li><li>Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+long-term+depression+in+cerebellar+Purkinje+cells+in+mice+carrying+mutated+GluA2+C+terminus.">Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).</li><li>De Schutter, E., Bower, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+membrane+model+of+the+cerebellar+Purkinje+cell+II.+Simulation+of+synaptic+responses.">An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses.</a> Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).</li><li>Swensen, A. 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C., Anchisi, D., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+current+mediated+by+metabotropic+glutamate+receptors+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).</li><li>Wang, S. S., Denk, W., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coincidence+detection+in+single+dendritic+spines+mediated+by+calcium+release.">Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release.</a> Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).</li><li>Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+signal+transduction+pathways+in+cerebellar+long-term+depression+by+kinetic+simulation.">Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cerebellar+engrams+in+short-term+and+long-term+motor+learning.">Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).</li><li>Inoshita, T., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+long-term+depression+in+the+cerebellar+flocculus+during+adaptation+of+optokinetic+response.">Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response.</a> eLife. 27, 36209 (2018).</li><li>Belmeguenai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+plasticity+complements+long-term+potentiation+in+parallel+fiber+input+gain+control+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).</li><li>Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SK2+channel+modulation+contributes+to+compartment+specific+dendritic+plasticity+in+cerebellar+Purkinje+cells.">SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 75, 108-120 (2012).</li></ol>

Diferenças entre os quatro protocolos
Nos protocolos de indução de LTD 1 e 2, CJS 300 vezes em 1 Hz é suficiente para induzir cerebelar LTD. a frequência de estimulação da FC pareceu estar em uma faixa fisiológica, pois a taxa de queima de espiga complexa em camundongos adultos alertas ("") foi relatada como sendo 1,25 Hz36. No entanto, a estimulação da FC isoladamente não ocasionou a plasticidade a longo prazo na sinapse PF-CF, conforme utilizado nos protocolo...

A organização sináptica das redes neuronais elaboradas do córtex cerebelar, composta por PCs, interneurônios de camada molecular (cesta e células esteladas), células de Golgi, PFs de células de grânulos, fibras Mossy e fibras de escalada (CFs), foram elucidados em termos de excitação/inibição e divergência/convergência, e o diagrama de circuitos bem organizados sugeriu que o cerebelo é uma "máquina neuronal"1, embora não houvesse anteriormente nenhuma idéia sobre a finalidade desta "máquina". Posteriormente, a Marr propôs que a entrada de PFs em PCs constitua uma rede de aprendizagem associativa de camada tripla2. Ele também sugeriu que cada CF transmite uma instrução cerebral para o movimento elementar2. Ele assumiu que a ativação simultânea de PFs e CF melhoraria a atividade da sinapse PF-PC, e causava potenciação a longo prazo (LTP) da sinapse PF-PC. Por outro lado, a Albus assumiu que a ativação síncrona de PFs e CF resultou em LTD nas sinapses PF-PC3. Ambos os estudos acima interpretam o cerebelo como um dispositivo original da memória, a incorporação de que na rede cortical cerebelar conduz à formação do modelo da máquina da aprendizagem do modelo de Marr-Albus.
Seguindo estas predições teóricas, duas linhas de evidência sugerem a presença de plasticidade sináptica no cerebelo. A primeira linha de evidência foi sugerida pela organização anatômica do floculus; aqui as vias MF de origem de órgãos vestibulares e vias CF de origem retiniana convergem nos PCs4. Este teste padrão original da convergência sugere que uma plasticidade sináptica que ocorre no flocculus cause a adaptação notável do reflexo vestíbulo-ocular. Segundo, a gravação da resposta dos PCs no floculado e o lesioning do floculus também apoiaram a hipótese acima de5,6,7. Além disso, o padrão de descarga do PC durante a adaptação do movimento da mão de um macaco8 apoiou a hipótese da plasticidade sináptica, especialmente a hipótese de Albus Ltd-3.
Para determinar a natureza da plasticidade sináptica diretamente, a estimulação conjuntivo repetida (CJS) de um pacote de PFS e o CF que inervam especificamente o PC in vivo foi mostrado para induzir o Ltd para a eficácia da transmissão do PF-PC sinapses9, 10,11. Nas explorações subseqüentes in vitro usando uma fatia cerebelar12 e PCes cultivados, a conjunção da estimulação cocultivada da pilha do grânulo e da estimulação da pilha verde-oliva13 ou a conjunção do glutamato após aplicado e somático despolarização14,15causou Ltd . O mecanismo de transdução de sinal subjacente à indução Ltd também foi intensivamente investigado por meio de preparações in vitro16,17.
As adaptações do VOR e do OKR foram usadas frequentemente para a avaliação quantitativa de efeitos da gene-manipulação na aprendizagem do motor cerebelar, porque o córtice vestibule-cerebelar foi provado ser a origem essencial na aprendizagem adaptativa do VOR18 ,19,20 e o okr19,21 a correlação entre a falha da indução do Ltd e o prejuízo da aprendizagem motora comportamental foi tomada como a evidência que Ltd desempenha um papel essencial no motor mecanismos de aprendizagem22. Essas visões são coletivamente referidas como a hipótese de Ltd de aprendizagem motora, ou hipótese de Marr-Albus-Ito23,24,25,26.
A aprendizagem adaptativa do movimento ocular foi mensurada por protocolos semelhantes, enquanto várias condições experimentais foram utilizadas para induzir o Ltd na preparação da fatia27,28,29,30,31 . Recentemente, Schonewille et al.26 relataram que alguns camundongos manipulados por genes demonstraram aprendizagem motora normal, mas as fatias Cerebelares não mostraram o Ltd e, assim, concluíram que a Ltd não era essencial para a aprendizagem motora. Entretanto, a indução de LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo na temperatura ambiente. Daqui, nós usamos diversos tipos de protocolos LTD-induzindo condições da gravação em torno de 30 ° c, e nós confirmamos que o LTD estêve induzido confiantemente nos ratos gene-manipulados usando estes protocolos em temperaturas physiological próximas32.
No entanto, permanecem algumas questões sobre as propriedades básicas da estimulação conjuntiva. O primeiro é a relação entre a forma do pico complexo e a amplitude de LTD. Em segundo lugar, em conjunto com a PF-estimulação e a despolarização somática, se o número de estímulos utilizados era necessário ou não era elusivo. No presente estudo, essas questões foram investigadas com camundongos tipo Wild (WT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices-Axon</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices-Axon</td>
			<td>Digidata1322A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>ISOflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse E600FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>MP1 Single Channel Pump</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water maker</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MilliQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for experiment</td>
			<td>Molecular probe-Axon</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for statistics</td>
			<td>KyensLab</td>
			<td>KyPlot 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of long-term depression induction in adult cerebellar slices

A plasticidade sináptica fornece um mecanismo de aprendizado e memória. Para a aprendizagem do motor cerebelar, a depressão a longo prazo (Ltd) de transmissões sináptica das fibras paralelas (PF) às pilhas de Purkinje (PC) é considerada a base para a aprendizagem do motor, e as deficiências do Ltd e da aprendizagem do motor são observadas em vários animais manipulados por genes. Conjuntos de aprendizagem motora comum, como a adaptação do reflexo optocinético (okr), o reflexo vestibular-ocular (VOR) e o teste de do foram utilizados para avaliação da capacidade de aprendizagem motora. Entretanto, os resultados obtidos dos camundongos Knock-in modificados no término do GluA2-carboxy demonstraram a adaptação normal do VOR e do OKR, apesar da falta de PF-LTD. Nesse relatório, a indução do LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo da estimulação na temperatura ambiente. Assim, as condições para induzir o LTD cerebelar foram exploradas nos mesmos mutantes do Knock-in que usam vários protocolos na temperatura fisiológica próxima. Finalmente, nós encontramos protocolos da estimulação, por que LTD poderia ser induzida nestes ratos gene-manipulados. Neste estudo, um conjunto de protocolos é proposto para avaliar a indução de LTD, o que permitirá um exame mais preciso da relação causal entre o LTD e a aprendizagem motora. Em conclusão, as condições experimentais são cruciais na avaliação de LTD em camundongos manipulados por genes.

Quatro protocolos foram utilizados neste estudo para induzir o cerebelar LTD. Nos dois primeiros protocolos (protocolo 1 e 2), aplicou-se a conjunção da PF-estimulação e a CF-estimulação condições de aperto atual. Nos outros dois protocolos (protocolo 3 e 4), a despolarização somática foi substituída para a CF-estimulação condições da tensão-braçadeira. Os traços de tensão ou traços de corrente durante a estimulação conjuntiva foram comparados (Figura 2).
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Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Em alguns animais gene-manipulados, usar um único protocolo pode não induzir o LTD em pilhas Cerebelares de Purkinje, e pode haver uma discrepância entre o LTD e a aprendizagem do motor. Os protocolos múltiplos são necessários avaliar a LTD-indução em animais gene-manipulados. Os protocolos padrão são mostrados.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Quando uma determinada função proteica é modificada por manipulação genética, a coordenação da falha irritante e do comprometimento do funcionamento motor é considerada uma condição necessária para a relação causal entre a LTD e a aprendizagem motora. Aqui demonstramos o uso de múltiplos protocolos para avaliar a LTD que pode ser induzida através de mecanismos compensatórios em animais manipulados por genes. Antes de colher o cérebro, esfrie e oxigene dois 50 mililitros de ACSF no gelo.Quando a temperatura da solução atingir abaixo de quatro graus celsius, adicione 50 microliters de uma tetrodotoxina mililitro a um dos béquers frios de gelo. Para colher o cérebro, segure a cabeça e use uma tesoura oftalmológica para cortar a pele superficial ao longo da linha média. Retrair manualmente a pele para expor amplamente a superfície do crânio e usar a tesoura para cortar ao longo horizontalmente do crânio do grande buraco spinocerebellar para pouco acima dos olhos e ouvidos antes de cortar o crânio ao longo de uma linha acima de ambos os olhos.Use um bisturi para cortar o cérebro no meio do cerebrum e isolar a parte caudal do cérebro, incluindo o cerebelo, do crânio. Mergulhe a amostra no béquer gelado do ACSF e ajuste a tubulação de bolha para que não mexa o bloco cerebral no béquer. Após pelo menos sete minutos, use uma espátula para pegar o bloco cerebral e use um pedaço de papel filtro para absorver qualquer excesso de ACSF.Monte o lado ventral do tecido para baixo em um pedaço de ágar de dois por dois centímetros com um adesivo médico apropriado. Use uma lâmina para cortar o hemisfério direito do tecido cerebral o mais paralelo ao plano dendrático das células Purkinje possível. Corte e remova o outro lado do hemisfério e corte o cérebro entre o coliculi superior e inferior.Corte a medula espinhal e cole o lado direito do cerebelo aparado com o bloco de ágar na bandeja de espécimes pré-refrigerados. Em seguida, inclinando a bandeja do espécime, despeje ACSF na amostra para fixar o tecido e lavar qualquer excesso de cola. Para cortar a amostra cerebral, oriente o espécime de tal forma que o lado dorsal do cerebelo esteja na frente e despeje o suficiente do acsf de corte frio de gelo complementado com tetrodotoxina para imergir completamente o cerebelo.Coloque um tubo de gás na solução de corte e inicie borbulhando com uma mistura de gás oxigênio-carbono. Usando pinças finas e lupas, remova o aracnoide mater e extire o peduncle cerebelar. Depois de remover o tronco cerebral e o bloco de ágar, gire a bandeja 180 graus para que a superfície dorsal do cerebelo fique de frente para a lâmina de barbear do vibratome e ajuste o primeiro local de corte.Ajuste a amplitude do vibratome para 5,5 e frequência para 85 Hertz, a velocidade para três a quatro, e a espessura da fatia para 300 micrômetros. À medida que as fatias cerebelares são obtidas, use uma rede de nylon para transferir as seções para uma incubadora de acrílico em um banho de água de 26 graus celsius e imergir completamente as amostras em ACSF oxigenado fresco por pelo menos uma hora. Para relatórios inteiros de grampos de remendo celular, dissolva uma picrotoxina micromolar em ACSF por ultasonicação por três minutos antes de perfundir uma câmara de gravação de 30 graus celsius com a solução de toxina a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto.Depois de alguns minutos, transfira uma fatia cerebelar para a câmara de gravação e fixe o tecido com um peso de platina e fios de nylon. Em seguida, encha um eletrodo estimulante com ACSF fresco. Para estimular as fibras paralelas, coloque o eletrodo estimulante na superfície da camada molecular a cerca de 50 micrômetros da camada celular purkinje.Para estimular as fibras de escalada, coloque o eletrodo estimulante na parte inferior da camada celular Purkinje e use um microcarregador para encher um eletrodo de gravação com oito microliters de 0,45 micrômetros filtrados de potássio ou solução interna baseada em césio. Aplique uma pressão positiva fraca no eletrodo de gravação antes de mergulhar o eletrodo no ACSF. A resistência ao eletrodo deve ser de dois a quatro megaohms e o potencial de junção líquida deve ser corrigido.Aproxime-se do corpo celular saudável e brilhante de uma célula Purkinje com o eletrodo de gravação e empurre ligeiramente a superfície da célula Purkinje. Em seguida, pare de aplicar a pressão positiva e aplique pressão negativa até que uma vedação gigaohm seja formada. Em seguida, use pressão negativa para estabelecer uma configuração celular inteira, mantendo o potencial da membrana em menos 70 milivolts e aplicando um menos dois milivolt 100 milissegundos pulsos a 0,1 hertz, monitoramento contínuo da resistência de entrada, resistência à série e capacitância de entrada.Para indução de depressão de longo prazo, estimule a camada molecular com um pulso de 0,1 milissegundo e aplique um estímulo de pulso duplo para identificar as correntes pós-sinápticas de fibra paralela. Deve-se observar uma facilitação de pulso emparelhada e um aumento gradual da amplitude em relação ao aumento da intensidade de estimulação. Para registrar a resposta ao teste, aplique um único pulso de 0,1 hertz e ajuste a intensidade do estímulo para que a amplitude evocada seja de cerca de 200 picoamps.Estimular as fibras de escalada na parte inferior da camada celular Purkinje e identificar as correntes pós-sinápticas de fibras paralelas provocadas pela ativação da fibra de escalada, aplique um estímulo de pulso duplo. Uma depressão de pulso pareada deve ser observada de forma total ou nenhuma em correlação com o aumento da intensidade de estimulação. Neste experimento representativo, foi utilizada uma conjunção de uma estimulação de fibras paralelas e uma estimulação de fibra de escalada sob as condições atuais do grampo.A forma do pico complexo provocado pela estimulação conjuntiva foi semelhante à provocada apenas pela estimulação da fibra de escalada com a primeira espeto íngreme seguida de dois a três espinhos. Um pico complexo de forma semelhante foi observado quando uma estimulação de fibras paralelas foi seguida 50 milissegundos mais tarde por um segundo paralelo conjuntivo e estimulação de fibras de escalada. Neste teste sob condições de grampo de tensão utilizando uma solução interna baseada em césio, uma estimulação de fibras paralelas foi seguida 50 milissegundos mais tarde por uma aplicação concomitante de uma segunda estimulação de fibras paralelas e despolarização somática.Uma corrente interior foi provocada após despolarização somática de menos 70 a zero milvolts e a corrente traseira também foi evocada após a repolarização. Finalmente, cinco estímulos paralelos de fibra a 100 hertz foram dados simultaneamente com a despolarização somática sob condições de grampo de tensão. Mais uma vez, uma geração repetitiva de correntes interiores foi provocada durante a despolarização e a corrente traseira foi induzida após a repolarização.Para avaliar a relação entre cerebelar LTD e aprendizagem motora em animais manipulados por genes, vários protocolos devem ser usados para induzir LTD em condições fisiológicas aconchegantes. Se a Cerebellar LTD for visualizada em animais manipulados por genes após o aprendizado motor, a relação causal entre eles pode ser mais diretamente examinada.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

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A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Neurociência

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

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Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

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Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

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