Name: assessment of long-term depression induction in adult cerebellar slices
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00
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Agradecemos a A. Oba por su asistencia técnica. Esta investigación fue parcialmente apoyada por Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 a K.Y.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité de RIKEN sobre el cuidado y uso de animales en experimentos. Los ratones fueron mantenidos en las instalaciones animales del Centro RIKEN para la Ciencia del Cerebro bajo una temperatura bien controlada (23-25 oC) y humedad (45%–65%) Condiciones. Se utilizaron ratones WT masculinos y femeninos (C57BL/6, 3-6 meses).
1. Preparación de soluciones utilizadas en los experimentos
NOTA:</stron...

<ol>
	<li>Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Cerebellum as a Neuronal Machine. , (1967).</li><li>Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theory+of+cerebellar+cortex.">A theory of cerebellar cortex.</a> Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).</li><li>Albus, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+cerebellar+function.">Theory of cerebellar function.</a> Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).</li><li>Maekawa, K., Simpson, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+gain+control+of+vestibulo-ocular+reflex+by+the+cerebellum.">Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum.</a> Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).</li><li>Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+activity+during+motor+learning.">Purkinje cell activity during motor learning.</a> Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).</li><li>Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climbing+fibre+induced+depression+of+both+mossy+fibre+responsiveness+and+glutamate+sensitivity+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).</li><li>Ito, M., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+depression+of+parallel+fiber-Purkinje+cell+transmission+induced+by+conjunctive+stimulation+of+parallel+fibers+and+climbing+fibers+in+the+cerebellar+cortex.">Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex.</a> Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).</li><li>Ekerot, C. F., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+depression+of+parallel+fibre+synapses+following+stimulation+of+climbing+fibres.">Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres.</a> Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).</li><li>Sakurai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+modification+of+parallel+fibre-Purkinje+cell+transmission+in+in+vitro+guinea-pig+cerebellar+slices.">Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices.</a> Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).</li><li>Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depression+and+potentiation+of+the+synaptic+transmission+between+a+granule+cell+and+a+Purkinje+cell+in+rat+cerebellar+culture.">Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture.</a> Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).</li><li>Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+depression+of+AMPA+currents+in+cultured+cerebellar+purkinje+neurons.">A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons.</a> Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).</li><li>Linden, D. J., Connor, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+postsynaptic+PKC+in+cerebellar+long-term+depression+in+culture.">Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture.</a> Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).</li><li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+long-term+depression:+characterization,+signal+transduction+and+functional+roles.">Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles.</a> Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).</li><li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+cerebellar+long-term+depression.">The molecular organization of cerebellar long-term depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).</li><li>Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+effects+of+unilateral+lesions+in+the+flocculus+upon+eye+movements+in+albino+rabbits.">Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits.</a> Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).</li><li>Nagao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+vestibulocerebellar+lesion+upon+dynamic+characteristics+and+adaptation+of+vestibulo-ocular+and+optokinetic+responses+in+pigmented+rabbits.">Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits.</a> Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).</li><li>Watanabe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+events+correlated+with+long-term+adaptation+of+the+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+in+the+primate+flocculus.">Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus.</a> Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).</li><li>van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABAergic+and+noradrenergic+injections+into+the+cerebellar+flocculus+on+vestibulo-ocular+reflexes+in+the+rabbit.">Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit.</a> Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).</li><li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+motor+learning+in+the+cerebellum.">Mechanism of motor learning in the cerebellum.</a> Brain Research. 886, 237-245 (2000).</li><li>De Schutter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+long-term+depression+might+normalize+excitation+of+Purkinje+cells:+a+hypothesis.">Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis.</a> Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).</li><li>Hansel, C., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+depression+of+the+cerebellar+climbing+fiber-Purkinje+neuron+synapse.">Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse.</a> Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).</li><li>Safo, P., Regehr, W. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+FMR1+in+Purkinje+cells+enhances+parallel+fiber+LTD,+enlarges+spines,+and+attenuates+cerebellar+eyelid+conditioning+in+Fragile+X+syndrome.">Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome.</a> Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).</li><li>Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+long-term+depression+in+cerebellar+Purkinje+cells+in+mice+carrying+mutated+GluA2+C+terminus.">Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).</li><li>De Schutter, E., Bower, J. 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M., Bean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanisms+of+burst+firing+in+dissociated+Purkinje+neurons.">Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).</li><li>Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+cytoskeletal+filaments+selectively+reduces+Na+and+Ca+spikes+in+cultured+mammal+neurones.">Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones.</a> Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).</li><li>Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. 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C., Anchisi, D., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+current+mediated+by+metabotropic+glutamate+receptors+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).</li><li>Wang, S. S., Denk, W., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coincidence+detection+in+single+dendritic+spines+mediated+by+calcium+release.">Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release.</a> Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).</li><li>Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+signal+transduction+pathways+in+cerebellar+long-term+depression+by+kinetic+simulation.">Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cerebellar+engrams+in+short-term+and+long-term+motor+learning.">Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).</li><li>Inoshita, T., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+long-term+depression+in+the+cerebellar+flocculus+during+adaptation+of+optokinetic+response.">Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response.</a> eLife. 27, 36209 (2018).</li><li>Belmeguenai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+plasticity+complements+long-term+potentiation+in+parallel+fiber+input+gain+control+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).</li><li>Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SK2+channel+modulation+contributes+to+compartment+specific+dendritic+plasticity+in+cerebellar+Purkinje+cells.">SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 75, 108-120 (2012).</li></ol>

Diferencias entre los cuatro protocolos
En los protocolos de inducción LTD 1 y 2, Cjs 300 veces a 1 Hz es suficiente para inducir la frecuencia de estimulación cerebelosa LTD. Sin embargo, la estimulación CF por sí sola no causó plasticidad a largo plazo en la sinapsis PF-CF, tal como se utiliza en los protocolos 1 y 2(Figura 4, Figura 5), aunque la estimulación CF sola a mayor frecuencia inducida LTD<sup c...

La organización sináptica de las redes neuronales elaboradas de la corteza cerebelosa, compuesta por PC, interneuronas de capa molecular (células de cesta y células estelares), células Golgi, PFs de células gráulas, fibras musgosas y fibras de escalada (CF), se han aclarado en términos de excitación/inhibición y divergencia/convergencia, y el diagrama de circuitos bien organizados ha sugerido que el cerebelo es una "máquina neuronal"1, aunque anteriormente no había idea sobre el propósito de esta "máquina". Más tarde Marr propuso que la entrada de PFs a los PC constituya una red de aprendizaje asociativo de triple capa2. También sugirió que cada CF transmitiera una instrucción cerebral para el movimiento elemental2. Asumió que la activación simultánea de los PF y el CF mejoraría la actividad de la sinapsis PF-PC y causaría la potenciación a largo plazo (LTP) de la sinapsis PF-PC. Por otro lado, Albus asumió que la activación síncrona de los PF y CF dio lugar a LTD en las sinapsis PF-PC3. Ambos estudios anteriores interpretan el cerebelo como un dispositivo de memoria único, la incorporación de los cuales en la red cortical cerebelosa conduce a la formación del modelo de máquina de aprendizaje Marr-Albus.
Después de estas predicciones teóricas, dos líneas de evidencia sugieren la presencia de plasticidad sináptica en el cerebelo. La primera línea de evidencia fue sugerida por la organización anatómica del floculus; aquí las vías MF de origen orgánico vestibular y las vías CF de origen retiniano convergen en los PC4. Este patrón de convergencia único sugiere que una plasticidad sináptica que ocurre en el floculus causa la notable adaptabilidad del reflejo vestibulo-ocular. En segundo lugar, el registro de la respuesta de los PC en el floculus y la lesión del floculus también apoyó la hipótesis anterior5,6,7. Además, el patrón de descarga de PC durante la adaptación del movimiento de la mano de un mono8 apoyó la hipótesis de plasticidad sináptica, especialmente la hipótesis LTD de Albus3.
Para determinar la naturaleza de la plasticidad sináptica directamente, se demostró que la estimulación conjuntiva repetida (Cjs) de un haz de Pf sFs y el CF que inerva específicamente el PC in vivo induce a LTD para la eficacia de transmisión de las sinapsis PF-PC9, 10,11. En las exploraciones in vitro posteriores utilizando una rebanada cerebelosa12 y PC cultivadas, la conjunción de estimulación de células de gránulos cocultivadas y estimulación de células de olivo13 o la conjunción de glutamato aplicado iontoforéticamente y somático despolarización14,15 causó LTD. El mecanismo de transducción de señales subyacente a la inducción LTD también se investigó intensivamente utilizando los preparados in vitro16,17.
Las adaptaciones del VOR y el OKR se utilizaron a menudo para la evaluación cuantitativa de los efectos de manipulación genética en el aprendizaje motor cerebeloso, porque se demostró que la corteza de vestibulo-cerebelosa era el origen esencial en el aprendizaje adaptativo del VOR18 ,19,20 y el OKR19,21 La correlación entre el fracaso de la inducción LTD y el deterioro del aprendizaje motor conductual se ha tomado como evidencia de que LTD desempeña un papel esencial en el motor mecanismos de aprendizaje22. Estas vistas se conocen colectivamente como la hipótesis LTD del aprendizaje motor, o la hipótesis De Marr-Albus-Ito23,24,25,26.
El aprendizaje adaptativo del movimiento ocular se midió utilizando protocolos similares, mientras que se utilizaron varias condiciones experimentales para inducir LTD en la preparación de rodajas27,28,29,30,31 . Recientemente, Schonewille y otros26 informaron que algunos ratones manipulados genéticamente demostraron un aprendizaje motor normal, pero las rodajas cerebelosas no mostraron LTD, y por lo que concluyeron que LTD no era esencial para el aprendizaje motor. Sin embargo, la inducción de LTD sólo se intentó utilizar un tipo de protocolo a temperatura ambiente. Por lo tanto, utilizamos varios tipos de protocolos inducidores de LTD en condiciones de registro a alrededor de 30 oC, y confirmamos que el LTD fue inducido de forma fiable en los ratones manipulados por genes mediante el uso de estos protocolos a temperaturas casi fisiológicas32.
Sin embargo, quedan algunas preguntas con respecto a las propiedades básicas de la estimulación conjuntiva. La primera es la relación entre la forma del pico complejo y la amplitud de LTD. En segundo lugar, junto con la estimulación de la PF y la despolarización somática, si el número de estímulos utilizados era necesario o no era esquiva. En el presente estudio, estas preguntas se investigaron utilizando ratones de tipo salvaje (WT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices-Axon</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices-Axon</td>
			<td>Digidata1322A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>ISOflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>Eclipse E600FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>MP1 Single Channel Pump</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water maker</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MilliQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for experiment</td>
			<td>Molecular probe-Axon</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for statistics</td>
			<td>KyensLab</td>
			<td>KyPlot 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1078</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of long-term depression induction in adult cerebellar slices

La plasticidad sináptica proporciona un mecanismo para el aprendizaje y la memoria. Para el aprendizaje motor cerebeloso, la depresión a largo plazo (LTD) de las transmisiones sinápticas de fibras paralelas (PF) a células Purkinje (PC) se considera la base para el aprendizaje motor, y las deficiencias de LTD y el aprendizaje motor se observan en varios animales manipulados por genes genéticos. Se utilizaron conjuntos comunes de aprendizaje motor, como la adaptación del reflejo optocinético (OKR), el reflejo vestibular-ocular (VOR) y la prueba de rotarod para evaluar la capacidad de aprendizaje motor. Sin embargo, los resultados obtenidos de los ratones knock-in modificados de GluA2-carboxy demostraron una adaptación normal del VOR y el OKR, a pesar de la falta de PF-LTD. En ese informe, la inducción de LTD sólo se intentó utilizar un tipo de protocolo de estimulación a temperatura ambiente. Por lo tanto, las condiciones para inducir a LTD cerebeloso fueron exploradas en los mismos mutantes knock-in usando varios protocolos a temperatura casi fisiológica. Finalmente, encontramos protocolos de estimulación, por los cuales LTD podría ser inducido en estos ratones manipulados genéticamente. En este estudio, se propone un conjunto de protocolos para evaluar la inducción LTD, que permitirá con mayor precisión el examen de la relación causal entre LTD y el aprendizaje motor. En conclusión, las condiciones experimentales son cruciales a la hora de evaluar LTD en ratones manipulados por genes.

En este estudio se utilizaron cuatro protocolos para inducir a LTD cerebeloso. En los dos primeros protocolos (protocolo 1 y 2), la conjunción de la estimulación PF y la estimulación CF se aplicó en condiciones de abrazadera de corriente. En los otros dos protocolos (protocolo 3 y 4), la despolarización somática se sustituyó por la estimulación CF en condiciones de abrazadera de tensión. Se compararon los rastros de tensión o de corriente durante la estimulación coyuntura (Figura 2</strong...

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Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

En algunos animales manipulados por genes, el uso de un solo protocolo puede no inducir LTD en células de Purkinje cerebelosas, y puede haber una discrepancia entre LTD y el aprendizaje motor. Se utilizan varios protocolos para evaluar la inducción LTD en animales manipulados genéticamente. Se muestran los protocolos estándar.

Evaluación de la inducción a largo plazo de la depresión en rodajas de cerebelosores adultos

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Cuando una función proteica en particular se modifica mediante la manipulación génica, la coordinación de la insuficiencia irritativa y el deterioro del funcionamiento motor se considera una condición necesaria para la relación causal entre la LTD y el aprendizaje motor. Aquí demostramos el uso de múltiples protocolos para evaluar la LTD que pueden ser inducidos a través de mecanismos compensatorios en animales manipulados genéticamente. Antes de cosechar el cerebro, enfríe y oxigene dos vasos de 50 mililitros de ACSF sobre hielo.Cuando la temperatura de la solución alcance menos de cuatro grados centígrados, añada 50 microlitros de una tetrodotoxina milimétrica a uno de los vasos fríos. Para cosechar el cerebro, sostenga la cabeza y use tijeras oftalmológicas para cortar la piel superficial a lo largo de la línea media. Retraer manualmente la piel para exponer ampliamente la superficie del cráneo y utilizar las tijeras para cortar a lo largo del cráneo horizontalmente desde el agujero espinocerebeloso principal a justo por encima de los ojos y las orejas antes de cortar el cráneo a lo largo de una línea por encima de ambos ojos.Usa un bisturí para cortar el cerebro en el centro del cerebro y aislar la parte caudal del cerebro, incluido el cerebelo, del cráneo. Sumerja la muestra en el vaso de precipitados fríos de ACSF y ajuste el tubo de burbujas para que no remueva el bloqueo cerebral en el vaso de precipitados. Después de al menos siete minutos, usa una espátula para recoger el bloqueo cerebral y usa un pedazo de papel de filtro para absorber cualquier exceso de ACSF.Monte el lado ventral del tejido hacia abajo en una pieza de agar de dos por dos centímetros con un adhesivo médico apropiado. Utilice una cuchilla para cortar el hemisferio derecho del tejido cerebral tan paralelo al plano dendrítico de las células purkinje como sea posible. Cortar y quitar el otro lado del hemisferio y cortar el cerebro entre los colliculi superior e inferior.Cortar la médula espinal y pegar el lado derecho del cerebelo recortado con el bloque de agar en la bandeja de muestra pre-refrigerada. A continuación, inclinando la bandeja de la muestra, vierta ACSF sobre la muestra para fijar el tejido y lavar cualquier exceso de pegamento. Para cortar la muestra del cerebro, orientar la muestra de tal manera que el lado dorsal del cerebelo esté en la parte delantera y vierta suficiente del corte en frío con ACSF complementado con tetrodotoxina para sumergir completamente el cerebelo.Coloque un tubo de gas en la solución de corte e inicie el burbujeo con una mezcla de gas de dióxido de oxígeno y carbono. Usando pinzas finas y lupas, retire el mater aracnoideo e excime el pedúnculo cerebeloso. Después de retirar el tronco encefálica y el bloque de agar, gire la bandeja 180 grados para que la superficie dorsal del cerebelo se enfrente a la cuchilla de afeitar del vibratoma y ajuste la primera ubicación de corte.Establezca la amplitud del vibratomo en 5,5 y la frecuencia en 85 Hertz, la velocidad de tres a cuatro y el grosor de la rebanada en 300 micrómetros. A medida que se obtienen las rodajas de cerebeloso, utilice una red de nylon para transferir las secciones a una incubadora de acrílico en un baño de agua de 26 grados centígrados y sumerja completamente las muestras en ACSF fresco oxigenado durante al menos una hora. Para informes de abrazaderas de parches de células enteras, disuelva una picrotoxina micromolar en ACSF por ultasonicción durante tres minutos antes de perfundir una cámara de grabación de 30 grados centígrados con la solución de toxina a un caudal de dos mililitros por minuto.Después de unos minutos, transfiera una rebanada cerebelosa a la cámara de grabación y fije el tejido con un peso de platino y hilos de nylon. A continuación, llene un electrodo estimulante con ACSF fresco. Para estimular las fibras paralelas, coloque el electrodo estimulante en la superficie de la capa molecular a unos 50 micrómetros de la capa celular de Purkinje.Para la estimulación de las fibras de escalada, coloque el electrodo estimulante en la parte inferior de la capa celular de Purkinje y utilice un microcargador para llenar un electrodo de grabación con ocho microlitros de 0,45 micrómetros filtrados de potasio o cesio a base de solución interna. Aplique una presión positiva débil al electrodo de grabación antes de sumergir el electrodo en el ACSF. La resistencia del electrodo debe ser de dos a cuatro megaohms y se debe corregir el potencial de unión líquida.Acérquese al cuerpo celular brillante sano de una célula de Purkinje con el electrodo de grabación y empuje ligeramente la superficie de la célula de Purkinje. A continuación, deje de aplicar la presión positiva y aplique presión negativa hasta que se forme un sello de gigaohm. A continuación, utilice la presión negativa para establecer una configuración de célula completa, manteniendo el potencial de membrana en menos 70 milivoltios y aplicando un pulso de menos dos milivoltios de 100 milisegundos a 0,1 hercios, monitoreo continuo de la resistencia de entrada, resistencia en serie y capacitancia de entrada.Para la inducción de la depresión a largo plazo, estimule la capa molecular con un pulso de 0,1 milisegundos y aplique un estímulo de doble pulso para identificar las corrientes postsinápticas excitatorias de fibra paralela. Se debe observar una facilitación del pulso emparejado y un aumento gradual de la amplitud en relación con el aumento de la intensidad de la estimulación. Para registrar la respuesta de la prueba, aplique un solo pulso de hercio 0,1 y ajuste la intensidad del estímulo de modo que la amplitud evocada sea de alrededor de 200 picoamps.Estimular las fibras de escalada en la parte inferior de la capa celular de Purkinje e identificar las corrientes post-sinápticas excitatorias de fibra paralela provocadas por la activación de la fibra de escalada, aplicar un estímulo de doble pulso. Se debe observar una depresión del pulso emparejado de una manera total o nula en correlación con el aumento de la intensidad de la estimulación. En este experimento representativo, se utilizó una conjunción de una estimulación de fibra paralela y una estimulación de fibra de escalada en condiciones de abrazadera de corriente para la preparación de la rebanada.La forma de la espiga compleja provocada por la estimulación coyunta fue similar a la provocada por la estimulación de la fibra de escalada solo con la primera espiguilla empinada seguida de dos o tres espiguillas. Se observó un pico complejo de forma similar cuando una estimulación de fibra paralela fue seguida 50 milisegundos más tarde por una segunda estimulación paralela y de fibra de escalada. En esta prueba bajo condiciones de abrazadera de voltaje utilizando una solución interna basada en cesio, una estimulación de fibra paralela fue seguida 50 milisegundos más tarde por una aplicación concomitante de una segunda estimulación de fibra paralela y despolarización somática.Una corriente interna se provocó sobre la despolarización somática de menos 70 a cero milivoltios y la corriente de cola también se evocó después de la repolarización. Finalmente, cinco estímulos de fibra paralela a 100 hercios se dieron simultáneamente con la despolarización somática bajo condiciones de abrazadera de tensión. Una vez más, una generación repetitiva de corrientes interiores se provocó durante la despolarización y la corriente de cola fue inducida después de la repolarización.Para evaluar la relación entre la LTD cerebelosa y el aprendizaje motor en animales manipulados genéticamente, se deben utilizar múltiples protocolos para inducir LTD en condiciones fisiológicas acogedoras. Si la LTD cerebelosa se visualiza en animales manipulados genéticamente después del aprendizaje motor, la relación causal entre ellos puede examinarse más directamente.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Investigación

Neurociencias

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Seguimiento del comportamiento a largo plazo de Libremente Natación débilmente eléctrico Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Grabaciones simultáneas a largo plazo en dos etapas de procesamiento neuronal en Behaving abejas

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generación y Mantenimiento a Largo Plazo de Nervios<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Método de tubo de rodillo modificado precisamente localizada y repetitiva imagen intermitente durante el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro en un sistema cerrado

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

A largo plazo conflicto sensorial en comportarse libremente ratones

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...