Vi studerade tillgången på löslighet hos mikrometaller som zinks selen med olika kemiska former eller källor, som vi kallar det, i samband med att fodersammansättningen ändras. I en radionuklidsvit, väg ut cirka 0,2 gram malda atlantiska laxfoderprover och blanda det med en zinkradiator med känd specifik aktivitet i ett provrör med fem milliliter volym. Förbered sex andra alikvoter av bufferten och tillsätt en av de aminosyror som visas här för att nå en slutlig molkoncentration på fem millimolar.
Tillsätt tarmens luminala buffert i sötvatten för att mata provet. Lägg sedan till sötvattens intestinala luminalbufferten till buffert alikvoterna som innehåller aminosyrorna. Stäng rören och snurra dem på en roterande spinnare vid 25 varv/min i 30 minuter.
Centrifugera sedan vid 1, 157 x g i 10 minuter, för att separera de lösliga och lösliga fraktionerna. Använd en gamma teller för att mäta antalet per minut av zinkradiator i lösliga och lösliga fraktioner. Tvätta regnbågsöringen som härrör från tarmcellslinjen två gånger med en milliliter EDTA-lösning och sug ut lösningen efter varje tvätt med en pipett.
Behandla de tvättade cellerna med 0,25% trypsinlösning. Rotera kolven försiktigt i akuta vinklar i två minuter. Tillsätt sedan 10 milliliter L-15 medium som innehåller 5%FBS för att neutralisera trypsin.
Använd en steril pipett och dekantera den resulterande cellupphängningen i ett koniskt bottencentrifugrör. Centrifugera vid 130 x G i tre minuter. Sedan med hjälp av en hemocytometer, bestämma densiteten hos de skördade cellerna genom manuell räkning.
Frö cellerna på 24 brunnsplattor med en celltäthet på 50 000 celler per milliliter, per brunn, och inkubera plattorna vid 19 grader Celsius under en normal atmosfär i 48 timmar före experimenten. Efter att ha matat fisken i 11 dagar och avlivat dem, samla ett poolat prov av fiskens avföring genom att strippa från ventralfenan till anusen och placera den på en tallrik. Använd en spatel för att överföra avföringen från plattan till ett koniskt rör på 50 milliliter.
Förvara omedelbart proverna vid 20 grader Celsius. I denna studie bedöms mineraltillgången av fiskfoder med hjälp av ett antal kostnadsfria metoder. Representativ analys av atlantlaxfoder via metoden för storleksuteslutning av kromatografi induktivt kopplade plasmamasspektrometri, ger data om de zinkkemiska arter som finns i den lösliga fraktionen.
Fem zinkhaltiga toppar kan ses i denna fraktion, var och en med en annan molekylvikt. De zinkkemiska arter som finns i den lösliga fraktionen kan ha olika källor, eftersom det foder som används innehåller både marina och växtbaserade ingredienser och kompletteras. Molekylviktsintervallet för dessa arter tyder på att dessa föreningar kan vara metalloproteiner.
Medan lösligheten av kompletterad zink 65 ökar närvaron av alla testade aminosyror, finns högre löslighet med histidin och lysin. Apical zink upptag i Arteca GC celler påverkas avsevärt av förekomsten av L-Met eller DL-Met vid två millimolar koncentrationer. Dessutom påverkas effekten av metionin på zinkupptag negativt av närvaron av BCH.
Den största fördelen med detta protokoll är att vi försökte kombinera olika tillvägagångssätt i visuella, analytiska och invivo-studier, för att jämföra och komplettera varandra när det gäller att studera mineraltillgänglighet.