Name: a bioinformatics pipeline to accurately and efficiently analyze the microrna transcriptomes in plants
Uploaded: 2020-01-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants at JoVE.com

この研究は、北京農林科学アカデミー(KJCX201917、KJCX20180425、KJCX20180204)から中国国立自然科学財団(31621001)からLLに支援されています。

1. インストールとテスト
<ol><li>必要な依存関係をダウンロード: Bowtie222と RNAfold23.コンパイル済みパッケージをお勧めします。<ol>
<li>読み取りマッピングツールである Bowtie2 をホーム サイト (<a href="http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml" target="_blank">http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</a>) からダウンロードします。</li>
		<li>RNA二次構造を予測するた...

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (2), 94-108 (2009).</li><li>Bartel, D. 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L., Bologna, N. G., Chorostecki, U., Palatnik, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microRNA+processing+determinants+by+random+mutagenesis+of+Arabidopsis+MIR172a+precursor.">Identification of microRNA processing determinants by random mutagenesis of Arabidopsis MIR172a precursor.</a> Current Biology. 20 (1), 49-54 (2010).</li><li>Vitsios, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirnovo:+genome-free+prediction+of+microRNAs+from+small+RNA+sequencing+data+and+single-cells+using+decision+forests.">Mirnovo: genome-free prediction of microRNAs from small RNA sequencing data and single-cells using decision forests.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 177 (2017).</li></ol>

NGSの出現により、多様な種29、30におけるsRNAシーケンシングデータの増加量から多数のmiRNA遺伝子座が同定されている。集中型コミュニティデータベースmiRBase21では、寄託されたmiRNAアイテムが過去10年間でほぼ100倍に増加しています。しかし、動物のmiRNAと比較して、植物miRNAは、識別/注釈をより複雑にする多くのユニークな機能?...

生物学における過去20年間で最もエキサイティングな発見の一つは、ゲノム1の多様な機能を調節するsRNA種の増殖的役割である。特に、miRNAは真核生物において20~24-nt sRNAの重要なクラスを構成し、主にライフサイクル開発段階を通じて著名な遺伝子調節因子として転写後のレベルで機能するとともに、刺激およびストレス応答2、3において機能する。植物において、miRNAは、一般に個々の転写単位4、5としてRNAポリメラーゼIIによって転写されるpri-miRNAと呼ばれる一次転写物から生じる。進化的に保存された細胞機械(動物のドロシャ・RNase III、植物におけるDICER様)によって処理され、pri-miRNAは、分子内幹ループ構造を形成する配列を含む即時miRNA前駆体、プレmiRNAに切除される。その後、プレミRNAは、機能鎖、成熟miRNA、およびあまり頻繁に機能しないパートナー、miRNA*2、8からなる二本鎖中間体、すなわちmiRNA二重鎖に処理される。RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)にロードされた後、成熟したmiRNAは、配列相補性に基づいてmRNA標的を認識することができ、その結果、負の調節機能2、8をもたらす。miRNAは、ターゲットトランスクリプトを不安定にするか、ターゲット翻訳を防ぐことができますが、前者の方法は植物8、9で支配されています。
線虫カエノルハブディティス・エレガンス10、11における最初のmiRNAの発見以来、特にNGS法の入手後に、miRNA同定とその機能解析に多くの研究が行われてきた。NGS法の広範な応用は、前駆体の幹ループ構造や成熟miRNAおよびmiRNA*における配列読み取りの優先的蓄積など、miRNAのユニークな特徴を捕捉するように設計された計算ツールの利用を大幅に促進しました。その結果、研究者は多様な種のmiRNAを同定する上で顕著な成功を収めています。先に説明した確率モデル12に基づいて、NGSデータから植物miRNAを発見するための最初の計算ツールであるmiRDeep-P13を開発しました。miRDeep-Pは、より可変的な前駆体長と大きなパラロゴスファミリー13、14、15を特徴とするプラントmiRNAのデコードの課題を克服することを特に目的としました。そのリリース後、このプログラムは何千回もダウンロードされ、40以上の植物種16でmiRNA転写物に注釈を付けるために使用されています。miRDeep-PのようなNGSベースのツールによって推進され、パブリックmiRNAリポジトリmiRBase17に登録されたmiRNAの数が劇的に増加しており、2008年18年には約500 miRNA項目(リリース2.0)に比べて38,000以上のmiRNAアイテムがホストされています(リリース22.1)。
しかし、植物miRNAアノテーションから2つの新しい課題が生じている。第一に、偽陽性の高い比率は、次の理由で植物miRNAアノテーション16、19の品質に大きな影響を与えました:1)NGS sRNAライブラリからの内因性短絡干渉RNA(siRNA)の希薄さは、厳格なmiRNAアノテーション基準がないためにmiRNAとして誤って注釈付けされました。2)事前miRNA情報を持たない種については、NGSデータに基づいて予測される偽陽性を排除することは困難である。例としてmiRBaseを使用して、テイラーら20は、パブリックリポジトリ21(リリース21)の植物miRNAエントリの3分の1が説得力のある証拠を欠いて、植物miRNAファミリーの4分の3さえ疑わしいことを発見しました。第二に、大規模で複雑なゲノム16を有する植物miRNAを予測するための非常に時間のかかるプロセスとなる。これらの課題を克服するために、新しいフィルタリング戦略を追加し、スコアリングアルゴリズムを見直し、プラントmiRNAアノテーションの新しい基準を統合することでmiRDeep-Pを更新し、新しいバージョンのmiRDP2をリリースしました。さらに、徐々にゲノムサイズが増加するNGS sRNAデータセット(アラビドプシス、米、トマト、トウモロコシ、小麦)を用いてmiRDP2をテストしました。他の5つの広く使用されているツールとその古いバージョンと比較して、miRDP2はこれらのsRNAデータを解析し、精度と感度を向上させ、miRNA転写物をより速く分析しました。
miRDP2 パッケージの内容 miRDP2 パッケージは、準備された bash スクリプトによって順番に実行する必要がある 6 つの文書化された Perl スクリプトで構成されます。6 つのスクリプトのうち、3 つのスクリプト (convert_bowtie_to_blast.pl、 filter_alignments.pl、およびexcise_candidate.pl) は miRDeep-P から継承されます。その他のスクリプトは、元のバージョンから変更されます。6 つのスクリプトの機能については、以下で説明します。
preprocess_reads.plは、入力読み取りを含め、長すぎる読み取りまたは短すぎる読み取り (<19 nt または >25 nt)、Rfam ncRNA シーケンスと相関する読み取り、および RPM (100 万分の読み取り) による読み取りが 5 未満である。次に、スクリプトは既知の miRNA 成熟配列に関連付けられた読み取りを取得します。入力ファイルは、FASTA/FASTQ 形式のオリジナル読み取りであり、miRNA および ncRNA シーケンスへの読み取りマッピングの bowtie2 出力です。
RPM を計算する式は次のとおりです。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59864/59864equ01.jpg">
convert_bowtie_to_blast.plは、ボウタイ形式を BLAST 解析形式に変更します。BLAST 解析形式は、標準の NCBI BLASToutput 形式から派生したカスタム表形式で区切られた形式です。
filter_alignments.plは、ディープ シーケンシング読み取りのアライメントをゲノムにフィルター処理します。部分的な位置合わせとマルチアライメント読み取り (ユーザー指定の周波数カットオフ) をフィルター処理します。基本入力は、BLAST 解析形式のファイルです。
excise_candidate.plは、配置された読み取りをガイドラインとして使用して、参照シーケンスから潜在的な前駆体シーケンスを切り取ります。基本入力は、BLAST 解析形式のファイルと FASTA ファイルです。出力は、FASTA 形式のすべての潜在的な前駆体シーケンスです。
mod-miRDP.plには、植物固有のパラメータを使用してスコアリングシステムを変更することにより、コアmiRDeep-Pアルゴリズムから変更される2つの入力ファイル、シグネチャファイルと構造ファイルが必要です。入力ファイルはドットブラケット前駆体構造ファイルであり、配布署名ファイルを読み取ります。
mod-rm_redundant_meet_plant.plには、chromosome_length、前駆体、mod-miRDP.plによって生成されたoriginal_predictionの 3 つの入力ファイルが必要です。これは、2つの出力ファイル、非冗長予測ファイル、および新たに更新されたプラントmiRNA基準によってフィルタリングされた予測ファイルを生成します。出力ファイルの形式の詳細については、セクション 1.4 で説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computer/computing node</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Perl is required; at least 8 GB RAM and 100 GB storage are recommended</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline to accurately and efficiently analyze the microrna transcriptomes in plants

マイクロRNA(miRNA)は、転写後のレベルで遺伝子発現を調節する上で強力な役割を果たす植物や動物に広く存在する20〜24ヌクレオチド(nt)内因性小さなRNA(sRNA)である。次世代シーケンシング(NGS)法によるsRNAライブラリのシーケンシングは、過去10年間にmiRNA転写物を同定および分析するために広く採用されており、miRNA発見の急速な増加をもたらしました。しかし、配列化されたsRNAライブラリーの深さの増加と植物ゲノムのサイズと複雑さにより、植物miRNAアノテーションには2つの大きな課題が生じます。第一に、他の多くのタイプのsRNA、特に、sRNAライブラリからの短い干渉RNA(siRNA)は、多くの計算ツールによってmiRNAとして誤ってアノトされています。第二に、大規模で複雑なゲノムを持つ植物種におけるmiRNA転写物を解析するための非常に時間のかかるプロセスになります。これらの課題を克服するために、最近、新しいフィルタリング戦略を採用し、スコアリングアルゴリズムを見直し、新たに更新された植物miRNAを組み込むことにより、miRDeep-P(miRNAトランスクリプトーム解析のための一般的なツール)をmiRDeep-P2(略してmiRDP2)にアップグレードしました。注釈の条件。アラビドプシス、米、トマト、トウモロコシ、小麦を含むゲノム複雑度の増加を伴う5つの代表的な植物における配列SRNA集団に対してmiRDP2を試験した。この結果は、miRDP2 がこれらのタスクを非常に高い効率で処理したことを示しています。さらに、miRDP2は感度と精度に関する他の予測ツールを上回っています。まとめると、植物miRNAトランスクリプトムを分析するための迅速かつ正確なツールとしてmiRDP2を実証し、植物のmiRNAに対する注釈を改善するコミュニティを支援する上で有用なツールです。

本明細書に記載されるmiRNAアノテーションパイプラインmiRDP2は、アラビドプシス・タリアナ、オリザ・サティバ(米)、ソラナム・ライコペルシカム(トマト)、ゼア・メイス(トウモロコシ)およびトリティカム・アエスティブム(図1A)を含む、徐々に増加したゲノム長を有する5つの植物種から10の公共sRNA-seqライブラリーに適用さ...

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A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

バイオインフォマティクスパイプライン、すなわちmiRDeep-P2(略してmiRDP2)は、植物miRNA基準とオーバーホールされたアルゴリズムを備えており、特に複雑で大きなゲノムを持つ種に対して、植物のマイクロRNA転写物を正確かつ効率的に分析することができました。

植物におけるマイクロRNA転写物を正確かつ効率的に分析するバイオインフォマティクスパイプライン

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

miRDeep2は、植物開発において重要な転写調節因子であり、環境問題への対応に不可欠な植物マイクロRNAを正確に特定するために使用できます。miRDeep2は著しく短い実行時間を必要とし、特に大きなゲノムを有する植物のマイクロRNAを予測するために感度と精度の両方で優れた性能を発揮します。偽陽性と長い処理時間は、植物マイクロRNAアノテーションにおける課題です。新しいフィールディング戦略を追加し、スコアリングアルゴリズムを見直し、厳しい基準を統合することで、miRDeep2はこれらの問題を克服することができます。高信頼マイクロRNAアノテーションは、ゲノムの多様な機能を調節する上でのマイクロRNAの役割を発見するための基本です。ステップバイステップのガイダンスは、初めてマイクロRNAアオナタを使用するのに役立ちます。経験豊富な研究者にとって、この方法は他のツールよりもmiRDeep2を使用することの利点と利点を理解するのに役立ちます。miRDeep2 パッケージをインストールするには、miRDeep2 Web ページに移動して、tarball ファイルを取得します。次に、ダウンロードしたファイルのすべての内容を 1 つのフォルダーに展開し、フォルダーパスをパスに設定します。miRDeep2パイプラインをテストするには、テストデータと1つのフォーマットされたGSMシーケンシングファイルと1つのシロイヌナナゲノムファイルを含む予想出力をダウンロードし、ダウンロードしたすべてのファイルを現在の作業ディレクトリに移動します。圧縮されたタールボールファイルを抽出した後、シロイヌナズナのゲノム参照インデックスと非コードRNA参照インデックスを構築します。中間ファイルと結果をすべて含むuser_selected_folderに、フォルダが自動的に生成されます。miRDeep2 パイプラインは、テストデータを使用して実行できます。テスト出力を確認するには、タブ区切り出力ファイルを表示します。予測されたマイクロRNAの最終的な出力には、染色体ID、ストランド方向、代表的な読み取りID、前駆体ID、成熟miRNA位置、前駆体位置、成熟配列および前駆体配列を示すカラムが含まれます。次に、完了したステップに関する情報を提供するprogress_logファイルと、プログラムの出力と警告を含むscript_logファイルとscript_errファイルを確認します。パイプラインを実行する前に、入力読み取りが適切な形式に前処理されていることを確認するには、深いシーケンスの読み取りの 5 つの素端と 3 つの素端からアダプターを削除し、すべての FAST A 識別子が一意であることを確認します。各シーケンス識別子は、アンダースコア x と、深いシーケンス データセットで取得された正確なシーケンスのコピー番号を示す整数で終わる必要があります。一意のFAST A識別子を確保するために、参照インデックスを構築ID.Toにランニング番号を含め、対象の種のゲノム配列がインデックス化されている場合は、iGenomesウェブサイトからBowtie 2インデックスファイルをダウンロードしてください。次に、リボソームRNAを含むRNAファムからの主要な非コード配列を含む非マイクロRNA非コードRNAインデックスを構築し、RNA、小核RNA、小核核RNAを伝達し、他の非コードRNAフラグメントから騒々しい配列を除外する。miRDeep2 を使用して、深いシーケンスデータから新しいマイクロRNA を検出するには、パッケージ内で bash スクリプトを実行して分析パイプラインを開始します。読み取り先の異なる場所の数、Bowtie 2 を実行するための不一致数、および 100 万分の 1 読み取りのしきい値を必要に応じて変更できます。miRDeep2 出力を確認するには、自動生成されたoutput_folderのデータを表示します。この代表的な分析では、miRDeep2マイクロRNAアノテーションパイプラインを、示されたとおりに徐々に増加したゲノムサイズを有する5つの植物種から10のパブリックsRNA配列ライブラリに適用した。各種について、異なる組織からの2つの代表的な小RNAライブラリーとそのインデックスゲノム配列が2つの入力として処理される。以前の方法を使用すると、ゲノム処理には100時間以上かかるか、ゲノムの長さのために解析の途中で停止する場合があります。ただし、miRDeep2 は、これらの予測プロセスを、数分から時間まで著しく短い期間で終了します。このテストで使用された2つの配列付きシロイヌナズナシスの小さなRNAについては、miRDeep2は他のツールと比較して感度と精度の両方でより優れたパフォーマンスを発揮しました。プログラムの入力インデックスが正しいことを確認してください。たとえば、Bowtie インデックスでのみ Bowtie を使用し、大きなゲノムには大きなインデックス オプションを使用します。得られたマイクロRNAの標的は、マイクロRNA機能に関する洞察を提供できるシーケンシングデータを使用して予測することができる。miRDeep2は、特定の植物種におけるほとんどのマイクロRNAを正確かつ敏感に同定するために使用することができるので、マイクロRNA機能全体としての役割を検討することができる。

Research

JoVE Journal

Genetics

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

マイクロ Rna の齧歯動物の神経筋疾患を治療する遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用しての全身配信

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...