Name: isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00
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Wir möchten James P. Bridges für die wichtige Anleitung zu den Methoden für die Kultivierung von Primärzellen danken. Matthew J. Beucler wurde vom National Institutes of Health Training Grant T32-ES007250 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch die Stipendien der National Institutes of Health R01-AI121028 und R21-DE026267 an William E. Miller unterstützt.

Diese Protokolle und Studien wurden vom Institutional Review Board der Universität Cincinnati überprüft und genehmigt (Federal-wide Assurance #00003152, IRB-Protokoll 2016-4183). Speichelgewebe wird häufig in vielen Kopf-und Hals chirurgische nusziert und ist in der Regel unbeteiligtdurcht durch den bösartigen Prozess. Typischerweise wird frisch resektiertes Speicheldrüsengewebe innerhalb von 2-4 h nach der Entfernung vom Patienten verwendet (Abbildung 1A).
1....

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization.">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li></ol>

Salivary Dysfunktion stellt ein Anliegen für die Lebensqualität für diejenigen, die mit Sjögren-Syndrom sowie diejenigen, die Strahlentherapie für Krebse neben den Speicheldrüsen3,4,5, 16. Eine vorgeschlagene Therapie zur Behandlung dieser Patienten ist das Anwachsen funktioneller Speichelstammzellen oder Organoide in vitro, die dann in beschädigte Speicheldrüse eingeführt werden kön...

Bei Säugetieren sind die Speicheldrüsen in 3 Paare von Hauptspeicheldrüsen organisiert: die Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen. Es gibt auch eine Reihe von kleineren Drüsen auf der Zunge und verstreut in der Mundhöhle1. Die Hauptdrüsen sind verantwortlich für das Massenvolumen des erzeugten Speichels2. Neben dem antimikrobiellen Schutz durch sezernierte Faktoren ist der Speichel wichtig für den Prozess des Kauens und Schmierens von Lebensmitteln, während er durch die Speiseröhre geht2. Als solche, Speicheldrüsenfunktionsstörungen stellt ein medizinisches Problem, wo Betroffene, die nicht in der Lage sind, genug Speichel zu produzieren sind anfälliger für die Entwicklung von Krankheiten wie Zahnhöhlen oder orale Candidiasis3. Darüber hinaus führt reduzierter Speichel zu größeren Schwierigkeiten beim Essen und Verdauen von Lebensmitteln, die einen erheblichen Einfluss auf die Lebensqualität haben.
Speicheldrüsenfunktionsstörungen finden sich vor allem bei Patienten mit Sjögren-Syndrom, einer Autoimmunerkrankung oder bei Patienten mit Kopf- und Nackenkrebs, die einer Bestrahlungstherapie unterzogen wurden3,4,5, 6. Beschädigte sekretotische Acini in den Drüsen als Folge von Autoimmunität oder Strahlentherapie unterziehen sich keiner Selbsterneuerung, was dazu führt, dass ein Patient mit irreversiblen Schäden lebt6. Die Untersuchung von Speicheldrüsen hat auch die Aufmerksamkeit oder Forscher, die an Mechanismen der viralen Pathogenese interessiert. Einige Krankheitserreger, wie das menschliche Zytomegalievirus (HCMV), replizieren sich hartnäckig innerhalb der Speicheldrüsen, was dann die Übertragung des entstehenden Virus auf einen neuen Wirt über Speichel7,8ermöglicht. Daher besteht ein unerfülltes Bedürfnis, robuste und reproduzierbare In-vitro-Modelle von Speicheldrüsengewebe zu entwickeln, um eine Vielzahl medizinischer Probleme anzugehen und zu verstehen.
Mehrere Modelle des murinen Speicheldrüsensystems wurden als Ausgangspunkt verwendet, um die verschiedenen Epithelzellen zu verstehen und zu charakterisieren, die die Speicheldrüsen9,10bilden. Es gibt offensichtliche und große Unterschiede zwischen menschlichen und murinen Speicheldrüsen11. Vor allem die menschliche Ohrspeicheldrüse ist größer im Verhältnis zur submandibulären Drüse, während die Maus submanddibuläre und Ohrspeicheldrüse sind viel ähnlich in Größe1,2,11. Während verewigte menschliche submandibuläre Zelllinien existieren, gibt es große Bedenken, dass die verewigten Zellen den Phänotyp des primären Gewebes nicht genau aufrechterhalten, und sekundäre Bedenken, dass die verewigten Zellen nicht tatsächlich von Speichelepithel selbst12. Aus diesen Gründen gibt es ein Interesse und die Notwendigkeit, primäre speicheldrüsengewebe vom Menschen zu studieren.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung primärer Epithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für die Gewebekultur. Unser Protokoll basiert auf den Arbeiten von Pringle et al. und Tran et al. mit Änderungen, die vorgenommen wurden, um ihre Verfahren generell zu vereinfachen13,14. Erstens: Während das Protokoll von Tran et al. eine lange fünfstündige Inkubation zur enzymatischen Verdauung des Speicheldrüsengewebes fordert, war unser modifiziertes Protokoll mit nur einer Stunde Inkubation erfolgreich, ähnlich wie in Pringle et al. Zweitens verwenden wir verschiedene Enzyme für die Gewebeverdauung, vor allem verwenden wir Trypsin nicht, wie es im ursprünglichen Tran et al.-Protokoll verwendet wird, sondern verwenden eine Mischung aus Dispase und Kollagennase. Wir ziehen es vor, Trypsin in den ersten Verdauungsschritten zu vermeiden, da eine aktuelle Studie nahelegte, dass die Erstverdauung des Speichelgewebes durch Trypsin zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit führt, möglicherweise durch den Verlust einer seltenen Stammzellpopulation15. Schließlich bewirtschaften wir die Salisphären auf der Oberfläche der Kellermembranmatrix (BMM) mit einem kommerziell erhältlichen Medium, das ursprünglich für die Ausbreitung von Bronchialepithelzellen entwickelt wurde. Unser Protokoll kann verwendet werden, um Speicheldrüsenzellen aus Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen zu isolieren. Diese Zellen drücken Speicheldrüsenamylase und andere Speicheldrüsen-spezifische Gene aus, was darauf hindeutet, dass sie einen Phänotyp beibehalten, der dem von Speicheldrüsen-Acinar-Epithelzellenähnelt 7. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Speicheldrüsenkulturen aus >50 primären menschlichen Gewebeproben erzeugt. Darüber hinaus können die primären Speicheldrüsenzellen leicht kryokonserviert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt zu verwenden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">100 mm culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Bronchial Epithelial Cell Growth Media</td>
			<td style="width:132px;">Lonza</td>
			<td style="width:123px;">CC-3171</td>
			<td>Add bullet kit as per manufacturer&#39;s instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cell strainer 70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Charcoal stripped fetal bovine serum</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">12676-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Collagenase type III</td>
			<td style="width:132px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004182</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cryogenic Tube</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dispase</td>
			<td style="width:132px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">07923</td>
			<td>Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dulbecco phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">55-031-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">General Chemicals</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">PathClear Basement membrane extract</td>
			<td style="width:132px;">Cultrex</td>
			<td style="width:123px;">3432-005-01</td>
			<td>Thaw at 4 &#176;C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Six-well culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-079-742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers

Die Speicheldrüsen sind ein Ort von erheblichem Interesse für Forscher, die an mehreren Aspekten der menschlichen Krankheit interessiert sind. Ein Ziel der Forscher ist es, die Funktion der Drüsen wiederherzustellen, die durch Strahlentherapien oder aufgrund von Pathologien im Zusammenhang mit dem Sjögren-Syndrom geschädigt sind. Ein zweites Ziel der Forscher ist es, die Mechanismen zu definieren, durch die sich Viren im Drüsengewebe replizieren, wo sie dann Zugang zu Speicheldrüsenflüssigkeiten erhalten können, die für die horizontale Übertragung wichtig sind. Diese Ziele unterstreichen die Notwendigkeit eines robusten und zugänglichen In-vitro-Speicheldrüsenmodells, das von Forschern genutzt werden kann, die sich für die oben genannten sowie verwandten Forschungsbereiche interessieren. Hier diskutieren wir ein einfaches Protokoll, um Epithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen zu isolieren und sie in vitro zu vermehren. Unser Protokoll kann weiter optimiert werden, um den Anforderungen einzelner Studien gerecht zu werden. Kurz gesagt, Speicheldrüsengewebe wird mechanisch und enzymatisch getrennt, um einzelne Zellen oder kleine Zellhaufen zu isolieren. Die Auswahl für Epithelzellen erfolgt durch Beschichtung auf einer Kellermembranmatrix in Gegenwart von Medien, die optimiert sind, um das Epithelzellwachstum zu fördern. Diese resultierenden Kulturen können als dreidimensionale Cluster, als "Salisphären" bezeichnet, oder als Monolayer auf behandelten Kunststoff-Gewebekultur-Gerichten angebaut werden. Dieses Protokoll führt zum Auswuchs einer heterogenen Population hauptsächlich epitheliale Zellen, die für 5-8 Passagen (15-20 Populationsverdoppelungen) propagiert werden können, bevor sie sich einer zellulären Seneszenz unterziehen.

Zwei-drei Tage nach der Beschichtung von Zellen aus verdautem Gewebe auf BMM bilden Zellen leicht kleine Cluster, die sich weiterhin in der Größe von bis zu 15-20 Zellen pro Cluster ausdehnen werden (Abbildung 2A). Zelluläre Trümmer und abgetrennte abgestorbene Zellen sind in der Regel zu sehen und sollten durch Ansaugen und Auffüllen mit frischen Medien entfernt werden. Zellen werden sich als Salisphären für etwa 3-10 Tage weiter ausbreiten, oder sola...

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Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Wir präsentieren eine Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer menschlicher Speicheldrüsen-abgeleiteten Epithelzellen. Diese Zellen zeigen Genexpressionsmuster, die mit ihrem Epithel-Ursprung übereinstimmen und können als Salisphären auf Kellermembranmatrizen aus Engelbreth-Holm-Schwarm-Tumorzellen oder als Monolayer auf behandelten Kulturgerichten angebaut werden.

Isolierung von Speicheldrüsenepithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für In-Vitro-Wachstum als Speicheldrüsen oder Monolayer

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Die Erzeugung primärer zellulärer Modelle oder organoidähnlicher Strukturen ist der Schlüssel zur Beantwortung vieler zeitgenössischer Fragen in der Biologie. Zum Beispiel interessieren wir uns seit geraumer Zeit für die Mechanismen, die von menschlichen Viren verwendet werden, um die Replikation in der Speicheldrüse zu erleichtern, da es ein wichtiger Ort für die horizontale Übertragung ist. Die Entwicklung des in diesem Protokoll beschriebenen Salisphärensystems ist ein entscheidender Fortschritt in unserem Bestreben, diese Art von Fragen zu beantworten.Diese Technik ermöglicht es uns, Primärzellen aus einer Vielzahl von verschiedenen Patientenproben zu erzeugen. Die Zellmodelle erinnern eher an die In-vivo-Typsituation, da die Zellen nicht modelliert oder transformiert werden, wie viele Zelltypen, die häufig für In-vitro-Experimente verwendet werden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um ähnliche Zellen aus der primären submandibulären Drüse der Maus zu generieren, und das Protokoll wäre wahrscheinlich für andere Organe mit ähnlichen zellulären Strukturen nützlich.Innerhalb von zwei bis vier Stunden nach der Entfernung vom Patienten, auf einer Kulturplatte, verwenden Sie autoklavierte sterilisierte sezierte Schere und chirurgische Zange, um das Speicheldrüsengewebe in feine Stücke in der Größe von ein bis zwei Millimetern zu zerkleinern. Fügen Sie dem zerkleinerten Gewebe sechs Milliliter der Dispase/Collagenase-Lösung hinzu. Dann bei 37 Grad Celsius für ca. 30 Minuten bis eine Stunde inkubieren.Stören Sie das Gewebe durch Pipettieren mit einer fünf Milliliter serologischen Pipette 15 bis 20 Mal. Bei 37 Grad Celsius für weitere 30 Minuten bis eine Stunde inkubieren. Wiederholen Sie den Pipetten- und Inkubationsschritt zwei bis drei weitere Male oder bis das Gewebe einer Gülle ähnelt und leicht durch die Pipettenöffnung gehen kann.Um Brunnen mit BMM zu beschichten, langsam Pipette 500 Mikroliter von über Nacht aufgetaut BMM in jedem Brunnen einer sechs Brunnenplatte. Langsam wirbeln Sie die Platte, um das BMM gleichmäßig über die Brunnen zu verteilen. Dann inkubieren Sie die beschichteten Platten bei 37 Grad Celsius für mindestens 15 Minuten vor der Verwendung, damit das BMM verfestigen kann.Übertragen Sie zunächst die Dispase/Collagenase-Lösung, die homogenisiertes Gewebe enthält, auf ein 15 Milliliter konisches Rohr. Waschen Sie die Wand der Platte einmal mit sechs Milliliter DPBS, um die verbleibenden Zellen in das konische Rohr zu übertragen. Dann filtern Sie durch ein 70 Mikrometer Nylon-Netzzellsieb das Homogenat in ein neues 50 Milliliter konisches Rohr, um unverdautes Gewebe zu entfernen.Zentrifuge gespannte Zellen für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand. Dann setzen Sie das Zellpellet in 10 Milliliter 1X RBC Lyse Puffer wieder auf.Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie dann 20 bis 25 Milliliter DPBS hinzu, um den RBC-Lysepuffer zu neutralisieren und die Lyse von Speichelzellen zu minimieren. Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g.Weißes Zellpellet zeigt vollständige Lyse aller RBC. Wenn das Pellet eine rote Farbe hat, wiederholen Sie die Behandlung mit dem RBC-Lysepuffer. Den Überstand ansaugen und das Pellet in ein bis zwei Milliliter BEGM wieder aufhängen und dann die resuspendierten Zellen auf BMM-beschichtete Brunnen übertragen.Bei 37 Grad Celsius inkubieren. Einmal auf BMM plattiert, bilden sich Zellen über einen Zeitraum von zwei bis drei Tagen zu sphärischen Strukturen oder Salisphären. Zellen können als Salisphären für etwa fünf bis sieben Tage aufrechterhalten werden, bevor das BMM zu abbauen beginnt, so dass die Zellen auf den Kunststoff zugreifen und haften und als Monolayer wachsen.Zuerst die Medien aus den Brunnen ansaugen und jedem Brunnen einen Milliliter Dispase/Collagenase-Lösung hinzufügen. Bei 37 Grad Celsius ca. 15 Minuten oder bis sich das BMM weitgehend aufgelöst hat, inkubieren. Dann übertragen Sie die Zellen in ein 15 Milliliter konisches Rohr und waschen Brunnen einmal mit ein bis drei Milliliter DPBS, um die verbleibenden Zellen zu erhalten.Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter Trypsin wieder auf. Wieder bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren.Als Nächstes fügen Sie dem Rohr alle vollständigen Medien hinzu, die 10% Serum enthalten, um das Trypsin zu neutralisieren. Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand, um Restmedien, Trypsin und Serum zu entfernen und dann die Zellen in DPBS wieder auszusetzen.Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in BEGM wieder auf. Um das Pellet als Kugeln zu erhalten, die resuspendierten Zellen auf erstarrte BMM-beschichtete Kulturgerichte zu verfestigen.Kultur alle Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für fünf bis sieben Tage vor der Subkultivierung gehalten. Füttern Sie alle zwei bis drei Tage mit frischem BEGM. Um die Zellen als Monolayer auf Kunststoffkulturgeschirr zu vermehren, die BEGM-Medien aus der Schale zu saugen und einmal mit DBPS zu waschen, um Restmedien zu entfernen.Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten oder bis sich die Zellen vollständig gelöst haben. Neutralisieren Sie Trypsin mit vier Millilitern eines vollständigen Mediums, das 10% Serum enthält. Dann die Schale sanft kippen und Zellen auf ein 15 Milliliter konisches Rohr übertragen.Waschen Sie die Platte einmal mit etwa fünf Milliliter DPBS, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand.Um Restmedien zu entfernen, setzen Sie Zellen in sechs bis zehn Milliliter DPBS wieder aus. Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie in BEGM.Dann die Zellen auf die behandelten Kunststoff-Gewebekultur-Gerichte aufgeben. Kultur die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für fünf bis sieben Tage vor der Subkultivierung gehalten. Füttern Sie alle zwei bis drei Tage mit frischem BEGM.In diesem Protokoll bildeten Zellen nach der Beschichtung von Zellen aus dem verdauten Gewebe zwei bis drei Tage lang leicht kleine Cluster, die sich weiterhin in der Größe von bis zu 15 bis 20 Zellen pro Cluster ausdehnten. Salisphärenzellen wurden auf zellkultivierten behandelten Kunststoff endiziert und als Monolayer angebaut, wo sie eine Morphologie aufweisen, die mit Zellen epitheliaalen Ursprungs übereinstimmt. Die richtige aseptische Technik und Sorgfalt ist notwendig, um bakterielle oder Pilzkontamination zu vermeiden.Keine Menge an Antibiotika oder Antimykotika wird eine Kultur, die mit Mikroben schwärmen, retten. Wir beantworten Fragen zur viralen Pathogenese und -übertragung. Aber für andere, Dies bietet eine Möglichkeit, menschliche Speicheldrüsenzellen für eine beliebige Anzahl von Anwendungen wie Geweberegenerationstherapien zu studieren.Für uns, die menschliche Cytomegalievirus zu studieren, hat diese Technik uns erlaubt, die molekularen Mechanismen zu erforschen, die das Virus nutzt, um zu infizieren und schließlich auf neue Wirte zu übertragen. Nichts, was in diesem Protokoll verwendet wird, ist von Natur aus gefährlich, aber Vorsicht ist immer geboten, wenn menschliches Gewebe und jede Art von chemischen Reagenzien behandelt werden.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

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Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

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To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

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Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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