Name: isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

ברצוני להודות לג פ. ברידג על מתן הדרכה משמעותית למתודולוגיות המעורבות בתאים ראשוניים של מעגלי התפירה. מתיו J. ביופורד היה נתמך על ידי המכונים הלאומיים של מלגת הכשרת בריאות T32-ES007250. עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים R01-AI121028 ו R21-DE026267 הוענק לוויליאם E. מילר.

פרוטוקולים ומחקרים אלה נבדקו ואושרו על ידי מועצת הסקירה המוסדית באוניברסיטת סינסינטי (הביטחון הפדרלי-רחב00003152, IRB פרוטוקול 2016-4183). רקמת הרוק הוא בדרך כלל resected הרבה הראש והצוואר כירורגי הליכים והוא בדרך כלל אינו מעורב על ידי תהליך ממאיר. בדרך כלל, רקמת בלוטת הרוק טרי resected משמש בתוך 2-4 h לאחר הה...

<ol>
	<li>Kessler, A. T., Bhatt, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Major+and+Minor+Salivary+Glands,+Part+1:+Anatomy,+Infectious,+and+Inflammatory+Processes.">Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes.</a> Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).</li><li>Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Biogenesis+and+Regeneration+of+Salivary+Glands.">Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands.</a> Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).</li><li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+Treatment+of+the+Consequences+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 213-225 (2003).</li><li>Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Main+Oral+Manifestations+in+Immune-Mediated+and+Inflammatory+Rheumatic+Diseases.">Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases.</a> Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).</li><li>Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-year+observation+of+patients+with+primary+Sj&#246;gren's+syndrome:+Initial+presenting+characteristics+and+the+associated+outcomes.">Ten-year observation of patients with primary Sj&#246;gren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes.</a> International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).</li><li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+A+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review.</a> Cancer. 107, 2525-2534 (2006).</li><li>Morrison, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+cell+model+for+the+study+of+human+cytomegalovirus+replication+and+spread+within+salivary+epithelium.">Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium.</a> Journal of Virology. , (2018).</li><li>Pomeroy, C., Englund, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus:+epidemiology+and+infection+control.">Cytomegalovirus: epidemiology and infection control.</a> American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).</li><li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+In+Vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals.">Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).</li><li>Varghese, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+cell+aggregates+are+derived+from+self-organization+of+acinar+lineage+cells.">Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells.</a> Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).</li><li>Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+human+and+mouse+salivary+glands:+A+practice+guide+for+salivary+researchers.">Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers.</a> Oral Diseases. , (2018).</li><li>Lin, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+the+human+salivary+gland+HSG+cell+line+with+HeLa+cells:+A+STR+analysis+study.">Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study.</a> Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).</li><li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Polarized+Human+Salivary+Epithelial+Cells+for+Use+in+Developing+an+Artificial+Salivary+Gland.">Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland.</a> Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Salivary+Gland+Stem+Cells.">Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Primary+Epithelial+Cells+Derived+from+Human+Salivary+Gland+Contributing+to+in+vivo+Formation+of+Acini-like+Structures.">Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures.</a> Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).</li><li>Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 199-212 (2003).</li><li>Cannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+measures+study+of+weekly+and+daily+cytomegalovirus+shedding+patterns+in+saliva+and+urine+of+healthy+cytomegalovirus-seropositive+children.">Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children.</a> BMC Infect. Dis. 14, (2014).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Salivary+Gland+Stem+Cells+Functionally+Restore+Radiation+Damaged+Salivary+Glands:+Hyposalivation+Cell+Therapy.">Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy.</a> STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).</li><li>Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+improves+functional+properties+of+human+submandibular+salivary+gland+cell+line.">Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43, 622-631 (2011).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture:+Differentiation+of+Salivary+Stem/Progenitor+Cells.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).</li><li>Foraida, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization.">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li></ol>

תפקוד הרוק מייצג דאגה לאיכות החיים עבור אלה הסובלים מתסמונת sjöגרנה, כמו גם אלה שעברו טיפול הקרנות סרטן בסמוך לבלוטות הרוק3,4,5, . שישה עשרה אחד הציע טיפול כדי לטפל בחולים אלה היא לגדל תאים גזע הרוק פונקציונלי או אורגנואיד?...

ביונקים בלוטות הרוק מאורגנים 3 זוגות של בלוטות הרוק הגדולות: הפרוטיד, תת הלסת, ואת בלוטות המשנה. קיימת גם סדרה של בלוטות קטין הממוקם על הלשון ומפוזרים ברחבי חלל אוראלי1. בלוטות הגדולות אחראים נפח בצובר של רוק המיוצר2. בנוסף למתן הגנה מיקרוביאלית באמצעות גורמים מופרש, רוק חשוב בתהליך של לעיסת מזון שימון כפי שהוא עובר דרך הוושט2. ככזה, תפקוד בלוטת הרוק מייצג בעיה רפואית שבה הסובלים שאינם מסוגלים לייצר רוק מספיק נוטים יותר לפתח חלות כגון חללים שיניים או הקנאזיס אוראלי3. בנוסף, מופחתת הרוק גורמת לקושי רב יותר לאכול ולעכל את המזון בעל השפעה משמעותית על איכות החיים.
תפקוד בלוטת הרוק נמצא בעיקר בחולים הסובלים מתסמונת sjöגרנה, הפרעה אוטואימונית, או בחולים עם סרטן ראש וצוואר שעברו טיפול הקרנה3,4,5, . שישה מטרים הפרשה הפגומה acini בתוך הבלוטות כתוצאה של חסינות אוטומטית או טיפול בקרינה לא עוברים התחדשות עצמית, אשר גורמת לחולה החיים עם נזק בלתי הפיך6. המחקר של בלוטות הרוק צברה גם את תשומת הלב או החוקרים המעוניינים מנגנונים של פתוגנזה נגיפית. כמה פתוגנים, כגון cytomegalovirus ירוס האדם (מימן), בהתמדה שכפול בתוך בלוטות הרוק, אשר לאחר מכן מאפשר שידור של וירוס המתהווה למחשב מארח חדש דרך רוק7,8. לפיכך, יש צורך לא מתקיים לפתח חזק ומלא מודלים של בלוטת הרוק להתמודד ולהבין מגוון מגוון של בעיות רפואיות.
מספר דגמים של מערכת בלוטת הרוק murine שימשו נקודת התחלה כדי להבין ולאפיין את התאים האפיתל השונים היוצרים את בלוטות הרוק9,10. קיימים הבדלים ברורים ועיקריים בין בלוטות הרוק אדם מורטין11. בעיקר בלוטת הפרוטיד האנושית גדולה יותר ביחס לבלוטת הלסת התחתונה ואילו הלסת התחתונה והפרוטיד דומים הרבה בגודלם1,2,11. בעוד מונצח האדם קווי הלסת התחתונה קיים, יש חששות עיקריים כי התאים מונצח לא לשמור במדויק את הפנוטיפ של הרקמה הראשונית חששות משניים כי התאים המודרים אינם נגזרים בפועל מ אפיתל הרוק עצמו12. מסיבות אלה יש עניין וצורך ללמוד רקמת הרוק העיקרי מבני אדם.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבודד תאים אפיתל העיקרי מבלוטות הרוק האנושי לתרבות רקמות. הפרוטוקול שלנו מבוסס על יצירותיו של פרינגל ואח ' וטראן ואח '. עם שינויים שבוצעו בדרך כלל לפשט את הנהלים שלהם13,14. ראשית, בזמן שפרוטוקול טראן ואח ' מתקשר לדגירה ארוכה של חמש שעות לעיכול הרוק, הפרוטוקול המתוקן שלנו הצליח עם מעט כמו דגירה של שעה אחת, בדומה לזה בפרינגל ואח '. שנית, אנו משתמשים באנזימים שונים לצורך עיכול רקמות, בעיקר איננו משתמשים בטריפסין כפי שנעשה בשימוש בפרוטוקול Tran et al המקורי, אך במקום זאת להשתמש בתערובת של dispase ו קולגן. אנו מעדיפים להימנע מטריפסין בצעדי העיכול הראשוניים כמחקר שנערך לאחרונה, הציע כי העיכול הראשוני של רקמת הרוק על ידי טריפסין תוצאות מופחתת הכדאיות התא, ואולי על ידי אובדן של אוכלוסיה נדירה של תאי גזע15. לבסוף, אנו התרבות הערבה על פני השטח של מטריקס קרום המרתף (BMM) באמצעות מדיה זמין מסחרית ניסח במקור עבור התפשטות של תאים אפיתל הסימפונות. הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לבודד את תאי הרוק מן הפרוטיד, הלסת התחתונה, ובלוטות תת לשוני. תאים אלה לבטא עמילז הרוק ו גנים ספציפיים אחרים הרוק המציין כי הם שומרים על פנוטיפ דומה לזה של תאים הרוק האפיתל שכבתית7. הצלחנו להפיק בהצלחה תרבויות הרוק מ > 50 דגימות הרקמות האנושיות הראשיות באמצעות מתודולוגיה זו. יתר על כן, התאים הרוק העיקרי יכול בקלות להיות הקפאת שמורות לשימוש במועד מאוחר יותר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">100 mm culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Bronchial Epithelial Cell Growth Media</td>
			<td style="width:132px;">Lonza</td>
			<td style="width:123px;">CC-3171</td>
			<td>Add bullet kit as per manufacturer&#39;s instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cell strainer 70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Charcoal stripped fetal bovine serum</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">12676-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Collagenase type III</td>
			<td style="width:132px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004182</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cryogenic Tube</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dispase</td>
			<td style="width:132px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">07923</td>
			<td>Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dulbecco phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">55-031-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">General Chemicals</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">PathClear Basement membrane extract</td>
			<td style="width:132px;">Cultrex</td>
			<td style="width:123px;">3432-005-01</td>
			<td>Thaw at 4 &#176;C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Six-well culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-079-742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers

בלוטות הרוק הם אתר של עניין משמעותי עבור החוקרים המעוניינים היבטים מרובים של המחלה האנושית. מטרה אחת של החוקרים היא לשחזר פונקציה של בלוטות ניזוק על ידי טיפולים קרינה או עקב הפתווגיות הקשורים תסמונת Sjöגרנה. המטרה השנייה של חוקרים היא להגדיר את המנגנונים שבהם וירוסים לשכפל בתוך רקמת הבלוטות שבו הם יכולים לקבל גישה נוזלי הרוק חשוב עבור הילוכים אופקית. מטרות אלה להדגיש את הצורך חזק ונגיש במודל בלוטת הרוק מבחנה שיכול להיות מנוצל על ידי חוקרים המעוניינים המוזכרים לעיל, כמו גם אזורי מחקר קשורים. כאן אנו דנים פרוטוקול פשוט כדי לבודד תאים אפיתל מבלוטות הרוק האנושי להפיץ אותם בתוך מבחנה. הפרוטוקול שלנו יכול להיות ממוטב נוסף כדי לענות על הצרכים של מחקרים אישיים. בקצרה, רקמת הרוק היא מכנית ואנזימטי מופרדים כדי לבודד תאים בודדים או אשכולות קטנים של תאים. בחירה עבור תאים אפיתל מתרחשת על ידי ציפוי על מטריצה קרום המרתף בנוכחות של מדיה אופטימיזציה לקידום צמיחת תאים אפיתל. ניתן לתחזק את התרבויות הללו כאשכולות תלת-ממדיים, הנקראת "כדורי הערבה", או לגדול כמונאולייר על מנות תרבות של רקמה פלסטית. פרוטוקול זה מביא את הצמיחה של אוכלוסיית הטרוגניים בעיקר תאים אפיתל שניתן להפיץ עבור 5-8 מעברים (15-20 האוכלוסייה טווח) לפני שעברו הזדקנות הסלולר.

שניים-שלושה ימים לאחר הציפוי התאים מרקמות מתעכל על BMM, תאים בקלות טופס אשכולות קטנים שימשיכו להרחיב בגודל של עד 15-20 תאים לכל אשכול (איור 2A). פסולת סלולרית ותאים מתים מנותקים נראים בדרך כלל ויש להסירו על ידי מועך ומחדש עם מדיה טרייה. תאים ימשיכו להתרבות כמו כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

אנו מציגים שיטה לבידוד וטיפוח תאים האפיתל בלוטת הרוק העיקרי של האדם. תאים אלה התערוכה ביטוי גנים דפוסי עקבי עם אותם להיות של מוצא האפיתל הרוק ניתן לגדל כמו כדורי הריר על מטריצות קרום מרתף נגזר אנגלברב-הולם-בתאי הגידול נחיל או כמו monolayers על מנות תרבות מטופלים.

בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

יצירת מודלים תאיים ראשוניים או מבנים דמויי אורגנואידים היא המפתח למענה על שאלות עכשוויות רבות בביולוגיה. לדוגמה, אנחנו כבר מעוניינים די הרבה זמן במנגנונים המשמשים וירוסים אנושיים כדי להקל על שכפול בלוטת הרוק כפי שהוא אתר חשוב עבור שידור אופקי. התפתחות המערכת המבוססת על סאליספרה המתוארת בפרוטוקול זה היא התקדמות מכרעת במסענו לענות על שאלות מסוג זה.טכניקה זו מאפשרת לנו ליצור תאים ראשוניים ממגוון דגימות מטופלים שונות. המודלים התאיים מזכירים יותר את מצב סוג in vivo מכיוון שהתאים אינם מודלים או משתנים כמו סוגי תאים רבים הנפוצים לניסויים במבחנה. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי ליצור תאים דומים מהבלוטות התת-ראשיות של העכבר והפרוטוקול עשוי להיות שימושי עבור איברים אחרים עם מבנים תאיים דומים.בתוך שעתיים עד ארבע שעות לאחר הסרת המטופל, על צלחת תרבות, להשתמש autoclaved מעוקרים ניתוח מספריים מלקחיים כירורגיים כדי לטחון את רקמת בלוטת הרוק לחתיכות בסדר בגודל של אחד עד שני מילימטרים. הוסף שישה מיליליטר של פתרון Dispase / קולגן לרקמה טחונה. ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ 30 דקות עד שעה אחת.לשבש את הרקמה על ידי צינורות עם פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר 15 עד 20 פעמים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לעוד 30 דקות עד שעה. חזור על שלב הצינור וההדרה פעמיים עד שלוש פעמים נוספות או עד שהרקמות דומות לתסרקה והוא יכול לעבור בקלות דרך פתח הפיפסה.כדי לצפות בארות עם BMM, לאט פיפטה 500 microliters של BMM מופשר לילה לתוך כל באר של צלחת שש באר. לאט מערבלים את הצלחת כדי להפיץ באופן שווה את ה- BMM מעל הבארות. לאחר מכן הדגירה את הצלחות מצופה ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות לפני השימוש כדי לאפשר BMM להתגבש.ראשית, להעביר את הפתרון Dispase / קולגנס המכיל רקמה הומוגנית לצינור חרוט 15 מיליליטר. לשטוף את הקיר של הצלחת פעם אחת עם שישה מיליליטר של DPBS להעביר את התאים הנותרים לתוך הצינור חרוט. לאחר מכן, באמצעות מסננת תאי רשת ניילון 70 מיקרומטר, לסנן את homogenate לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר כדי להסיר רקמה מעוכל.תאים מתוחים צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי. לאחר מכן בצע שימוש חוזר את גלולת התא ב- 10 מיליליטר של מאגר תות 1X RBC.דגירה במשך חמש דקות ב37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו 20 עד 25 מיליליטר של DPBS כדי לנטרל את מאגר התסיסה RBC ולמזער תזה של תאי רוק. צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g.גלולת תא לבן מצביעה על תזה מלאה של כל RBC. אם גלולה יש צבע אדום, טיפול חוזר עם חיץ תזה RBC. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור באחד עד שני מיליליטר של BEGM ולאחר מכן העברו את התאים המתווסכים לעל בארות מצופות BMM.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר צפוי על BMM, תאים ייווצרים לתוך מבנים כדוריים או salispheres על פני תקופה של יומיים עד שלושה ימים. תאים יכולים להישמר כמו salispheres במשך כחמישה עד שבעה ימים לפני BMM מתחיל להשפיל המאפשר לתאים לגשת לדבוק פלסטיק לגדול כמו monolayer.ראשית, שאפו את המדיה מה בארות והוסיפו מיליליטר אחד של פתרון Dispase/Collagenase לכל באר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ 15 דקות או עד BMM יש בעיקר נמס. ואז להעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר ולשטוף בארות פעם אחת עם אחד עד שלושה מיליליטר של DPBS כדי להשיג את התאים הנותרים.צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את גלולת הכדור בשני מיליליטר של טריפסין. דגירה שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.לאחר מכן, הוסף לצינור כל מדיה מלאה המכילה 10%serum כדי לנטרל את טריפסין. צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאפו את העל-טבעי כדי להסיר שאריות מדיה, טריפסין וסרום ולאחר מכן בצעו שימוש חוזר בתאים ב- DPBS.צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את גלולת הכדור ב- BEGM. כדי לשמור על גלולה כמו כדורים, צלחת התאים המתוחזקים על מנות תרבות מצופה BMM מוצק.תרבות כל התאים באינקובטור לח מתוחזק ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך חמישה עד שבעה ימים לפני תת תרבות. להאכיל עם BEGM טרי כל יומיים עד שלושה ימים. כדי להתרבות התאים כמו monolayer על כלי תרבות פלסטיק, שאפו את התקשורת BEGM מן המנה לשטוף פעם אחת עם DBPS כדי להסיר מדיה שיורית.מוסיפים שני מיליליטר של טריפסין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או עד התאים מנותקים לחלוטין. לנטרל טריפסין באמצעות ארבעה מיליליטר של כל מדיה מלאה המכילה 10%serum. לאחר מכן להטות בעדינות את המנה ולהעביר תאים לצינור חרוט 15 מיליליטר.לשטוף את הצלחת פעם אחת עם כחמישה מיליליטר של DPBS כדי לאסוף את התאים הנותרים. צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי.כדי להסיר מדיה שיורית, המתן מחדש תאים בשישה עד עשרה מיליליטר של DPBS. צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש ב-BEGM.ואז צלחת התאים על מנות תרבות רקמת פלסטיק מטופלים. תרבות התאים באינקובטור לח מתוחזק ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך חמישה עד שבעה ימים לפני תת תרבות. להאכיל עם BEGM טרי כל יומיים עד שלושה ימים.בפרוטוקול זה, לאחר ציפוי תאים מן הרקמה מתעכל על BMM במשך יומיים עד שלושה ימים, תאים בקלות יצרו אשכולות קטנים שהמשיכו להתרחב בגודל של עד 15 עד 20 תאים לכל אשכול. תאים Salisphere היו מצופים על תאים מתורבתים שטופלו פלסטיק וגדל כמו monolayer שבו הם מפגינים מורפולוגיה עולה בקנה אחד עם תאים ממוצא אפיתל. יש צורך בטכניקה וטיפול אספטיים נאותים כדי למנוע זיהום חיידקי או פטרייתי.שום כמות של אנטיביוטיקה או תרופות אנטי-מיקוטיות לא תציל תרבות שורצת חיידקים. אנחנו עונים על שאלות על פתוגנזה ויראלית והעברת. אבל עבור אחרים, זה מספק דרך ללמוד תאים הרוק האנושי עבור כל מספר של יישומים כגון טיפולים התחדשות רקמות.עבורנו שחוקרים ציטוםגלווירוס אנושי, טכניקה זו אפשרה לנו להתחיל לחקור את המנגנונים המולקולריים שהנגיף משתמש בהם כדי להדביק ובסופו של דבר להעביר למארחים חדשים. שום דבר המשמש בפרוטוקול זה הוא מסוכן מטבעו, אבל זהירות תמיד צריך להילקח בעת טיפול ברקמה אנושית וכל סוג של רייגנטים כימיים.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...