Name: isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

Ringraziamo James P. Bridges per aver fornito indicazioni significative sulle metodologie necessarie per la coltura delle cellule primarie. Matthew J. Beucler è stato sostenuto da National Institutes of Health Training Grant T32-ES007250. Questo lavoro è stato sostenuto anche dalle sovvenzioni dei National Institutes of Health R01-AI121028 e R21-DE026267 assegnate a William E. Miller.

Questi protocolli e studi sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Cincinnati (federal-wide Assurance #00003152, protocollo IRB 2016-4183). Il tessuto salivare è comunemente resected in molte procedure chirurgiche della testa e del collo e di solito non è coinvolto dal processo maligno. Tipicamente, il tessuto della ghiandola salivava appena resected viene utilizzato entro 2-4 h dopo la rimozione dal paziente (Figura 1A).
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La disfunzione salivare rappresenta una preoccupazione per la qualità della vita per coloro che soffrono di sindrome di Sjagren e per coloro che sono sottoposti a radioterapia per tumori adiacenti alle ghiandole salivari3,4,5, 16. Una terapia proposta per il trattamento di questi pazienti è quella di far crescere cellule staminali salivari funzionali o organoidi in vitro, che possono quindi ...

Nei mammiferi le ghiandole salivari sono organizzate in 3 coppie di principali ghiandole salivari: le ghiandole parotide, submandibolali e sublinguali. Esiste anche una serie di ghiandole minori situate sulla lingua e sparse in tutta la cavità orale1. Le principali ghiandole sono responsabili del volume sfuso di saliva prodotta2. Oltre a fornire protezione antimicrobica attraverso fattori secreti, la saliva è importante nel processo di masticazione e lubrificazione del cibo mentre passa attraverso l'esofago2. Come tale, disfunzione ghiandola salivare rappresenta un problema medico in cui i malati che non sono in grado di produrre abbastanza saliva sono più inclini a malattie in via di sviluppo come cavità dentali o candidiasi orale3. Inoltre, la riduzione della saliva comporta una maggiore difficoltà a mangiare e digerire il cibo avendo un impatto significativo sulla qualità della vita.
La disfunzione della ghiandola salivare si riscontra principalmente in pazienti affetti dalla sindrome di Sjagren, un disturbo autoimmune, o in pazienti con cancro alla testa e al collo che hanno subito una terapia di irradiola3,4,5 6. Gli acini di segreteria danneggiati all'interno delle ghiandole a seguito dell'autoimmunità o della radioterapia non subiscono l'auto-rinnovamento, il che si traduce in un paziente che vive con danni irreversibili6. Lo studio delle ghiandole salivari ha anche raccolto l'attenzione o i ricercatori interessati ai meccanismi della patogenesi virale. Alcuni patogeni, come il citomegalovirus umano (HCMV), si replicano persistentemente all'interno delle ghiandole salivari, che poi consente la trasmissione del virus nascente a un nuovo ospite tramite saliva7,8. Pertanto, vi è una necessità insoddisfatta di sviluppare modelli robusti e riproducibili in vitro di tessuto ghiandola salivare per affrontare e comprendere una vasta gamma di problemi medici.
Diversi modelli del sistema di ghiandola salivare murine sono stati utilizzati come punto di partenza per comprendere e caratterizzare le diverse cellule epiteliali che formano le ghiandole salivari9,10. Esistono differenze ovvie e principali tra le ghiandole salivari umane e murine11. In particolare la ghiandola parotide umana è più grande rispetto alla ghiandola submandibolare, mentre il topo submandibolare e parotide sono molto simili nella dimensione1,2,11. Sebbene esistano linee di cellule submandibolali umane immortalate, ci sono grandi preoccupazioni che le cellule immortalate non mantengano accuratamente il fenotipo del tessuto primario e le preoccupazioni secondarie che le cellule immortalate non sono effettivamente derivate da salivare epitelio stesso12. Per questi motivi c'è un interesse e la necessità di studiare il tessuto salivare primario dall'uomo.
Qui descriviamo un protocollo per isolare le cellule epiteliali primarie dalle ghiandole salivari umane per la coltura dei tessuti. Il nostro protocollo si basa sulle opere di Pringle et al. e Tran et al. con modifiche apportate per semplificare generalmente le loro procedure13,14. In primo luogo, mentre il protocollo di Tran et al.richiede una lunga incubazione di cinque ore per digerire ezigmaticamente il tessuto salivare, il nostro protocollo modificato ha avuto successo con un minimo di incubazione di un'ora, simile a quella di Pringle et al. In secondo luogo, usiamo diversi enzimi per la digestione tissutale, in particolare non usiamo la trypsin come viene utilizzato nel protocollo originale di Tran et al., ma usiamo invece una miscela di dispasi e collagenase. Preferiamo evitare la trypsinnelle nei passaggi di digestione iniziali come un recente studio ha suggerito che la digestione iniziale del tessuto salivare da trypsin risultati in ridotta vitalità cellulare, forse dalla perdita di una popolazione di cellule staminali rare15. Infine, procupiamo le salisfere sulla superficie della matrice della membrana seminterrato (BMM) utilizzando un supporto disponibile in commercio originariamente formulato per la propagazione delle cellule epiteliali bronchiali. Il nostro protocollo può essere utilizzato per isolare le cellule salivari dalle ghiandole parotide, submandibolare e sublinguali. Queste cellule esprimono amilasi salivare e altri geni salivari specifici che indicano che mantengono unfenotipo simile a quello delle cellule epiteliali acinari 7 . Abbiamo generato con successo colture salivari da >50 campioni primari di tessuto umano utilizzando questa metodologia. Inoltre, le cellule salivari primarie possono essere facilmente crioconservate per l'uso in un secondo momento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">100 mm culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Bronchial Epithelial Cell Growth Media</td>
			<td style="width:132px;">Lonza</td>
			<td style="width:123px;">CC-3171</td>
			<td>Add bullet kit as per manufacturer&#39;s instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cell strainer 70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Charcoal stripped fetal bovine serum</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">12676-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Collagenase type III</td>
			<td style="width:132px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004182</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cryogenic Tube</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dispase</td>
			<td style="width:132px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">07923</td>
			<td>Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dulbecco phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">55-031-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">General Chemicals</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">PathClear Basement membrane extract</td>
			<td style="width:132px;">Cultrex</td>
			<td style="width:123px;">3432-005-01</td>
			<td>Thaw at 4 &#176;C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Six-well culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-079-742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers

Le ghiandole salivari sono un sito di notevole interesse per i ricercatori interessati a molteplici aspetti della malattia umana. Uno degli obiettivi dei ricercatori è quello di ripristinare la funzione delle ghiandole danneggiate dalle terapie radiologiche o a causa di patologie associate alla sindrome di Sjàgren. Un secondo obiettivo dei ricercatori è quello di definire i meccanismi con cui i virus si replicano all'interno del tessuto ghiandolare dove possono quindi ottenere l'accesso a fluidi salivari importanti per la trasmissione orizzontale. Questi obiettivi evidenziano la necessità di un modello di ghiandola salivare in vitro robusto e accessibile che possa essere utilizzato dai ricercatori interessati alle suddette aree di ricerca. Qui discutiamo di un semplice protocollo per isolare le cellule epiteliali dalle ghiandole salivari umane e propagarle in vitro. Il nostro protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per soddisfare le esigenze dei singoli studi. In breve, il tessuto salivare è separati meccanicamente ed enzimaticamente per isolare singole cellule o piccoli ammassi di cellule. La selezione per le cellule epiteliali avviene placcando su una matrice di membrana seminterrato in presenza di media ottimizzati per promuovere la crescita delle cellule epiteliali. Queste colture risultanti possono essere mantenute come cluster tridimensionali, definite "salispheres", o coltivate come un monostrato su piatti di coltura dei tessuti plastici trattati. Questo protocollo si traduce nella crescita di una popolazione eterogenea di cellule principalmente epiteliali che possono essere propagate per 5-8 passaggi (15-20 raddoppi della popolazione) prima di sottoporsi alla senescenza cellulare.

Due-tre giorni dopo la placcatura delle cellule dal tessuto digerito su BMM, le cellule formeranno facilmente piccoli cluster che continueranno ad espandersi fino a 15-20 cellule per cluster (Figura 2A). I detriti cellulari e le cellule morte staccate sono tipicamente visti e dovrebbero essere rimossi aspirando e reintegrandosi con supporti freschi. Le cellule continueranno a proliferare come salifere per circa 3-10 giorni, o finché lo strato BMM rimane inta...

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Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Presentiamo un metodo per isolare e coltivare cellule epiteliali derivate dalla ghiandola umana primaria. Queste cellule presentano modelli di espressione genica coerenti con loro di origine epiteliale salivari e possono essere coltivate come salisfere su matrici di membrana seminterrato derivate da cellule tumorali Engelbreth-Holm-Swarm o come monostrati su piatti di coltura trattati.

Isolamento delle cellule epiteliali salivari dalle ghiandole salivari umane per la crescita in vitro come Salispheres o Monostrati

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Generare modelli cellulari primari o strutture organoidi è la chiave per rispondere a molte domande contemporanee in biologia. Ad esempio, siamo interessati da un bel po 'di tempo ai meccanismi utilizzati dai virus umani per facilitare la replicazione nella ghiandola salivare in quanto è un sito importante per la trasmissione orizzontale. Lo sviluppo del sistema basato sulla salisfera descritto in questo protocollo è un progresso cruciale nella nostra ricerca di rispondere a questo tipo di domande.Questa tecnica ci consente di generare cellule primarie da una varietà di diversi campioni di pazienti. I modelli cellulari ricordano più la situazione di tipo in vivo in quanto le cellule non sono modellate o trasformate come molti tipi di cellule comunemente usati per esperimenti in vitro. Abbiamo usato questo protocollo per generare cellule simili dalla ghiandola submandibolare primaria del topo e il protocollo sarebbe probabilmente utile per altri organi con strutture cellulari simili.Entro due o quattro ore dalla rimozione dal paziente, su una piastra di coltura, utilizzare forbici sterilizzate autoclavate e forcelle chirurgiche per tritare il tessuto della ghiandola salivare in pezzi fini delle dimensioni di uno o due millimetri. Aggiungere sei millilitri della soluzione di dispasi/collagenasi al tessuto tritato. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per circa 30 minuti a un'ora.Interrompere il tessuto tubazione con una pipetta sierologica da cinque millilitri da 15 a 20 volte. Incubare a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti a un'ora. Ripetere il passaggio di pipettazione e incubazione da due a tre volte o fino a quando il tessuto assomiglia a un liquame e può facilmente passare attraverso l'apertura della pipetta.Per rivestire i pozzi con BMM, pipettare lentamente 500 microlitri di BMM scongelato durante la notte in ogni pozzo di una piastra a sei pozzi. Ruotare lentamente la piastra per distribuire uniformemente il BMM sui pozzi. Quindi incubare le piastre rivestite a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti prima dell'uso per consentire al BMM di solidificarsi.In primo luogo, trasferire la soluzione di dispasi/collagenasi contenente tessuto omogeneizzato in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare la parete della piastra una volta con sei millilitri di DPBS per trasferire le celle rimanenti nel tubo conico. Quindi, attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 70 micrometri, filtrare l'omogeneato in un nuovo tubo conico da 50 millilitri per rimuovere il tessuto non digerito.Centrifugare le cellule tese per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante. Quindi rimescolare il pellet cellulare in 10 millilitri di tampone di lisi 1X RBC.Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere da 20 a 25 millilitri di DPBS per neutralizzare il tampone di lisi RBC e ridurre al minimo la lisi delle cellule salivari. Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g.Il pellet a celle bianche indica lalisi completa di tutta la RBC. Se il pellet ha colore rosso, ripetere il trattamento con tampone di lysis RBC. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in uno o due millilitri di BEGM e quindi trasferire le celle rimorsi su pozzi rivestiti in BMM.Incubare a 37 gradi Celsius. Una volta placcate su BMM, le cellule si formeranno in strutture sferiche o salisfere per un periodo di due o tre giorni. Le cellule possono essere mantenute come salisfere per circa cinque-sette giorni prima che il BMM inizi a degradarsi permettendo alle cellule di accedere e aderire alla plastica e crescere come monostrato.In primo luogo, aspirare il supporto dai pozzi e aggiungere un millilitro di soluzione di dispasi / collagenasi ad ogni pozzo. Incubare a 37 gradi Celsius per circa 15 minuti o fino a quando la BMM non si è per lo più sciolta. Quindi trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e lavare i pozzetti una volta con uno o tre millilitri di DPBS per ottenere le celle rimanenti.Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in due millilitri di Tripina. Incubare di nuovo a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Aggiungere quindi al tubo qualsiasi supporto completo contenente il 10% di siero per neutralizzare la tripina. Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante a rimuovere il supporto residuo, la tripsiderina e il siero e quindi rimescolare le cellule in DPBS.Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in BEGM. Per mantenere il pellet come sfere, placcare le celle rimostrate su piatti di coltura rivestiti in BMM solidificato.Coltura di tutte le cellule in un incubatore umidificato mantenuto a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per cinque o sette giorni prima della subcultura. Nutrire con BEGM fresco ogni due o tre giorni. Per proliferare le cellule come monostrato su stoviglie di coltura in plastica, aspirare il supporto BEGM dal piatto e lavare una volta con DBPS per rimuovere i mezzi residui.Aggiungere due millilitri di tripside e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti o fino a quando le cellule non si sono completamente staccate. Neutralizzare la tripina utilizzando quattro millilitri di qualsiasi supporto completo contenente il 10% di siero. Quindi inclinare delicatamente il piatto e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri.Lavare la piastra una volta con circa cinque millilitri di DPBS per raccogliere le cellule rimanenti. Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante.Per rimuovere i supporti residui, rimorsidire le celle in da sei a 10 millilitri di DPBS. Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante e resuspend in BEGM.Quindi placcare le cellule sui piatti di coltura del tessuto plastico trattato. Coltura le cellule in un incubatore umidificato mantenute a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per cinque o sette giorni prima della subcultura. Nutrire con BEGM fresco ogni due o tre giorni.In questo protocollo, dopo aver placcato le cellule dal tessuto digerito alla BMM per due o tre giorni, le cellule formarono prontamente piccoli cluster che continuarono ad espandersi in dimensioni fino a 15-20 cellule per cluster. Le cellule della salisfera sono state placcate su plastica trattata in cellule coltivate e coltivate come monostrato dove mostrano una morfologia coerente con le cellule di origine epiteliale. È necessaria una corretta tecnica aseptica e cura per evitare contaminazioni batteriche o fungine.Nessuna quantità di antibiotici o antimicotici salverà una coltura brulicante di microbi. Stiamo rispondendo a domande sulla patogenesi virale e sulla trasmissione. Ma per altri, questo fornisce un modo per studiare le cellule salivari umane per qualsiasi numero di applicazioni come le terapie di rigenerazione tissutale.Per noi che studiamo il Citomegalovirus umano, questa tecnica ci ha permesso di iniziare ad esplorare i meccanismi molecolari che il virus utilizza per infettare e infine trasmettere a nuovi ospiti. Nulla di ciò che viene utilizzato in questo protocollo è intrinsecamente pericoloso, ma si dovrebbe sempre prestare attenzione quando si maneggiano tessuti umani e qualsiasi tipo di reagente chimico.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

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