Name: isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00
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Nos gustaría dar las gracias a James P. Bridges por proporcionar una orientación significativa sobre las metodologías involucradas para el cultivo de células primarias. Matthew J. Beucler fue apoyado por la Beca T32-ES007250 de los Institutos Nacionales de Capacitación en Salud. Este trabajo también fue apoyado por las becas de los Institutos Nacionales de Salud R01-AI121028 y R21-DE026267 otorgadas a William E. Miller.

Estos protocolos y estudios han sido revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Cincinnati (Federal-wide Assurance #00003152, protocolo IRB 2016-4183). El tejido salival se reseca comúnmente en muchos procedimientos quirúrgicos de cabeza y cuello y generalmente no está involucrado por el proceso maligno. Típicamente, el tejido de la glándula salival recién resecado se utiliza dentro de 2-4 h después de la extracción del paciente (Figura1A)....

<ol>
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La disfunción salival representa una preocupación por la calidad de vida de los que sufren el síndrome de Sjogren, así como por los que se someten a radioterapia para cánceres adyacentes a las glándulas salivales3,4,5, 16. Una terapia propuesta para tratar a estos pacientes es cultivar células madre salivales funcionales u organoides in vitro, que luego se pueden insertar en la glándul...

En los mamíferos, las glándulas salivales se organizan en 3 pares de glándulas salivales principales: las glándulas parótidas, submandibulares y sublinguales. También existe una serie de glándulas menores ubicadas en la lengua y dispersas por toda la cavidad oral1. Las glándulas principales son responsables del volumen mayor de saliva producida2. Además de proporcionar protección antimicrobiana a través de factores secretos, la saliva es importante en el proceso de masticar y lubricar los alimentos a medida que pasa a través del esófago2. Como tal, la disfunción de la glándula salival representa un problema médico donde los enfermos que son incapacesde producir suficiente saliva son más propensos a desarrollar enfermedades como caries dentales o candidiasis oral 3. Además, la reducción de la saliva da como resultado una mayor dificultad para comer y digerir los alimentos que tienen un impacto significativo en la calidad de vida.
La disfunción de la glándula salival se encuentra principalmente en pacientes que sufren del síndrome de Sjogren, un trastorno autoinmune, o en pacientes con cáncer de cabeza y cuello que se han sometido a terapia de irradiación3,4,5, 6. El secretor dañado acini dentro de las glándulas como resultado de la autoinmunidad o radioterapia no se somete a la auto-renovación, lo que resulta en un paciente que vive con daños irreversibles6. El estudio de las glándulas salivales también ha atraído la atención o investigadores interesados en los mecanismos de la patogénesis viral. Algunos patógenos, como el citomegalovirus humano (HCMV), se replican persistentemente dentro de las glándulas salivales, lo que permite la transmisión del virus naciente a un nuevo huésped a través de la saliva7,8. Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar modelos in vitro robustos y reproducibles de tejido de la glándula salival para abordar y entender una amplia gama de problemas médicos.
Varios modelos del sistema de glándulas salivales murinas se han utilizado como punto de partida paracomprender y caracterizar las diferentes células epiteliales que forman las glándulas salivales 9,10. Existen diferencias obvias y importantes entre las glándulas salivales humanas y murinas11. Más notablemente la glándula parótida humana es más grande en relación con la glándula submandibular mientras que el ratón submandibular y parótido son muy similares en tamaño1,2,11. Si bien existen líneas celulares submandibulares humanas inmortalizadas, hay grandes preocupaciones de que las células inmortalizadas no mantengan con precisión el fenotipo del tejido primario y las preocupaciones secundarias de las que las células inmortalizadas no se derivan realmente epitelio salival en sí12. Por estas razones hay un interés y una necesidad de estudiar el tejido salival primario de los seres humanos.
Aquí describimos un protocolo para aislar las células epiteliales primarias de las glándulas salivales humanas para el cultivo de tejidos. Nuestro protocolo se basa en las obras de Pringle et al. y Tran et al. con modificaciones realizadas para simplificar generalmente sus procedimientos13,14. En primer lugar, mientras que el protocolo de Tran et al. requiere una larga incubación de cinco horas para digerir enzimáticamente el tejido salival, nuestro protocolo modificado ha tenido éxito con tan solo una hora de incubación, similar a la de Pringle et al. En segundo lugar, utilizamos diferentes enzimas para la digestión de los tejidos, sobre todo no usamos la trippsina como se utiliza en el protocolo original De tran et al., sino que usamos una mezcla de dispensa y colagenasa. Preferimos evitar la trippsina en los pasos iniciales de digestión como un estudio reciente sugirió que la digestión inicial del tejido salival por trippsina resulta en una menor viabilidad celular, posiblemente por la pérdida de una población rara de células madre15. Por último, cultivamos las salisferas en la superficie de la matriz de membrana del sótano (BMM) utilizando un medio disponible comercialmente formulado originalmente para la propagación de células epiteliales bronquiales. Nuestro protocolo se puede utilizar para aislar las células salivales de las glándulas parótidas, submandibulares y sublinguales. Estas células expresan la amilasa salival y otros genes salivales específicos que indican que mantienen un fenotipo similar al de las células epiteliales del acinar salival7. Hemos generado con éxito cultivos salivales a partir de >50 muestras primarias de tejido humano utilizando esta metodología. Además, las células salivales primarias se pueden crioreservar fácilmente para su uso en una fecha posterior.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">100 mm culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Bronchial Epithelial Cell Growth Media</td>
			<td style="width:132px;">Lonza</td>
			<td style="width:123px;">CC-3171</td>
			<td>Add bullet kit as per manufacturer&#39;s instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cell strainer 70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Charcoal stripped fetal bovine serum</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">12676-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Collagenase type III</td>
			<td style="width:132px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004182</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cryogenic Tube</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dispase</td>
			<td style="width:132px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">07923</td>
			<td>Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dulbecco phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">55-031-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">General Chemicals</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">PathClear Basement membrane extract</td>
			<td style="width:132px;">Cultrex</td>
			<td style="width:123px;">3432-005-01</td>
			<td>Thaw at 4 &#176;C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Six-well culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-079-742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers

Las glándulas salivales son un sitio de interés significativo para los investigadores interesados en múltiples aspectos de la enfermedad humana. Uno de los objetivos de los investigadores es restaurar la función de las glándulas dañadas por las radioterapias o debido a patologías asociadas con el síndrome de Sjogren. Un segundo objetivo de los investigadores es definir los mecanismos por los cuales los virus se replican dentro del tejido glandular donde luego pueden obtener acceso a fluidos salivales importantes para la transmisión horizontal. Estos objetivos ponen de relieve la necesidad de un modelo de glándula salival in vitro robusto y accesible que pueda ser utilizado por investigadores interesados en lo mencionado anteriormente, así como áreas de investigación relacionadas. Aquí discutimos un protocolo simple para aislar las células epiteliales de las glándulas salivales humanas y propagarlas in vitro. Nuestro protocolo se puede optimizar aún más para satisfacer las necesidades de los estudios individuales. Brevemente, el tejido salival se separa mecánica y enzimáticamente para aislar células individuales o pequeños grupos de células. La selección de células epiteliales se produce mediante el enchapado en una matriz de membrana de sótano en presencia de medios optimizados para promover el crecimiento de células epiteliales. Estos cultivos resultantes pueden mantenerse como racimos tridimensionales, llamados "salisferas", o crecer como monocapa en platos de cultivo de tejidos plásticos tratados. Este protocolo resulta en el crecimiento de una población heterogénea de células principalmente epiteliales que se pueden propagar para 5-8 pasajes (15-20 duplicaciones de población) antes de someterse a senescencia celular.

Dos-tres días después de las células de chapado del tejido digerido en BMM, las células formarán fácilmente pequeños racimos que continuarán expandiéndose en tamaño hasta 15-20 células por racimo (Figura2A). Los desechos celulares y las células muertas desprendidas se ven típicamente y deben ser eliminados aspirando y reponiendo con medios frescos. Las células continuarán proliferando como salisferas durante unos 3-10 días, o mientras la capa ...

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Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Presentamos un método para aislar y cultivar células epiteliales derivadas de glándulas salivales humanas primarias. Estas células exhiben patrones de expresión génica consistentes con que son de origen epitelial salival y pueden ser cultivadas como salisferas en matrices de membranas de sótano derivadas de células tumorales Engelbreth-Holm-Swarm o como monocapas en platos de cultivo tratados.

Aislamiento de células epiteliales salivales de glándulas salivales humanas para el crecimiento in vitro como salisferas o monocapas

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Generar modelos celulares primarios o estructuras organoides es clave para responder a muchas preguntas contemporáneas en biología. Por ejemplo, hemos estado interesados durante bastante tiempo en los mecanismos utilizados por los virus humanos para facilitar la replicación en la glándula salival, ya que es un sitio importante para la transmisión horizontal. El desarrollo del sistema basado en salisfera descrito en este protocolo es un avance crucial en nuestra búsqueda de responder a este tipo de preguntas.Esta técnica nos permite generar células primarias a partir de una variedad de muestras de pacientes diferentes. Los modelos celulares recuerdan más a la situación del tipo in vivo, ya que las células no se modelan ni transforman como muchos tipos de células comúnmente utilizados para experimentos in vitro. Hemos utilizado este protocolo para generar células similares a partir de la glándula submandibular primaria del ratón y el protocolo probablemente sería útil para otros órganos con estructuras celulares similares.Dentro de dos a cuatro horas después de la extracción del paciente, en una placa de cultivo, utilice tijeras diseccionadas esterilizadas autoclaves y fórceps quirúrgicos para picar el tejido de la glándula salival en trozos finos del tamaño de uno a dos milímetros. Añadir seis mililitros de la solución de Dispase/Collagenase al tejido picado. Luego incubar a 37 grados centígrados durante aproximadamente 30 minutos a una hora.Interrumpir el tejido pipeteando con una pipeta serológica de cinco mililitros de 15 a 20 veces. Incubar a 37 grados centígrados durante otros 30 minutos a una hora. Repita el pipeteo y la incubación paso de dos a tres veces más o hasta que el tejido se asemeje a una suspensión y pueda pasar fácilmente a través de la abertura de la pipeta.Para cubrir pozos con BMM, pipetee lentamente 500 microlitros de BMM descongelado durante la noche en cada pozo de una placa de seis pozos. Gire lentamente la placa para distribuir uniformemente el BMM sobre los pozos. A continuación, incubar las placas recubiertas a 37 grados Centígrados durante al menos 15 minutos antes de su uso para permitir que la MMC se solidifique.En primer lugar, transfiera la solución dispase/Collagenase que contiene tejido homogeneizado a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave la pared de la placa una vez con seis mililitros de DPBS para transferir las células restantes al tubo cónico. Luego, a través de un colador de células de malla de nylon de 70 micrómetros, filtre el homogeneato en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para eliminar el tejido no digerido.Centrifugar las células tensadas durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar al sobrenadante. A continuación, resuspender el pellet celular en 10 mililitros de 1X tólilis de RBC tampón.Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Luego agregue de 20 a 25 mililitros de DPBS para neutralizar el búfer de la lesis RBC y minimizar la lysis de las células salivales. Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g.El pellet de células blancas indica la lelisis completa de todo el RBC. Si el pellet tiene color rojo, repita el tratamiento con tampón de lyis RBC. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en uno a dos mililitros de BEGM y luego transferir las células resuspendidas a pozos recubiertos de BMM.Incubar a 37 grados centígrados. Una vez chapadas en BMM, las células se formarán en estructuras esféricas o saliesferas durante un período de dos a tres días. Las células se pueden mantener como saliesferas durante unos cinco a siete días antes de que el BMM comience a degradarse permitiendo que las células accedan y se adhieran al plástico y crezcan como una monocapa.En primer lugar, aspirar los medios de los pozos y añadir un mililitro de solución dispase/Collagenase a cada pozo. Incubar a 37 grados centígrados durante aproximadamente 15 minutos o hasta que BMM se haya disuelto en su mayoría. Luego transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y lave los pozos una vez con uno a tres mililitros de DPBS para obtener las células restantes.Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en dos mililitros de Trypsin. Incubar de nuevo a 37 grados centígrados durante 15 minutos.A continuación, agregue al tubo cualquier medio completo que contenga 10% de suero para neutralizar la Tripsina. Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar el sobrenadante para eliminar los medios residuales, la trippsina y el suero y luego resuspender las células en DPBS.Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en BEGM. Para mantener el pellet como esferas, plato las células resuspendidas en platos de cultivo recubiertos de BMM solidificados.Cultivo de todas las células en una incubadora humidificada mantenida a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante cinco a siete días antes de la subcultor. Alimentar con BEGM fresco cada dos o tres días. Para proliferar las células como monocapa en platos de cultivo plástico, aspirar los medios BEGM del plato y lavar una vez con DBPS para eliminar los medios residuales.Añadir dos mililitros de Trypsin e incubar a 37 grados Celsius durante 15 minutos o hasta que las células se hayan desprendido por completo. Neutralizar la trippsina utilizando cuatro mililitros de cualquier medio completo que contenga 10% de suero. Luego incline suavemente el plato y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros.Lave la placa una vez con aproximadamente cinco mililitros de DPBS para recoger las células restantes. Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar al sobrenadante.Para eliminar medios residuales, resuspender las células en seis a 10 mililitros de DPBS. Centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g. Aspirar el sobrenadante y resuspend en BEGM.A continuación, plato de las células en los platos de cultivo de tejido plástico tratado. Cultivo de las células en una incubadora humidificada mantenida en 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante cinco a siete días antes de la subcultor. Alimentar con BEGM fresco cada dos o tres días.En este protocolo, después de enchapar las células del tejido digerido en BMM durante dos a tres días, las células formaron fácilmente pequeños racimos que continuaron expandiéndose en tamaño hasta 15 a 20 células por racimo. Las células saliesferas fueron chapadas en plástico tratado cultivado en células y cultivadas como una monocapa donde exhiben morfología consistente con células de origen epitelial. Se necesita una técnica y un cuidado asépticos adecuados para evitar la contaminación bacteriana o fúngica.Ninguna cantidad de antibióticos o antimicóticos salvará un cultivo lleno de microbios. Estamos respondiendo preguntas sobre la patogénesis viral y la transmisión. Pero para otros, esto proporciona una manera de estudiar las células salivales humanas para cualquier número de aplicaciones tales como terapias de regeneración de tejidos.Para nosotros que estudiamos el citomegalovirus humano, esta técnica nos ha permitido comenzar a explorar los mecanismos moleculares que el virus utiliza para infectar y, en última instancia, transmitir a nuevos huéspedes. Nada de lo utilizado en este protocolo es inherentemente peligroso, pero siempre se debe tener precaución al manipular el tejido humano y cualquier tipo de reactivos químicos.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Investigación

Inmunología e Infección

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

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Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

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La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

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Hibridación<em&gt; In situ</em&gt; De las glándulas salivales, los ovarios y embriones de los mosquitos vectores

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Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

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Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

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Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

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Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...