Name: isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

Biz birincil hücreler kültür için yer metodolojileri önemli rehberlik sağlamak için James P. Bridges teşekkür etmek istiyoruz. Matthew J. Beucler sağlık eğitim hibe T32-ES007250 Ulusal Enstitüleri tarafından destekleniyordu. Bu çalışma Ayrıca Ulusal Sağlık Bursları R01-AI121028 ve R21-DE026267 tarafından William E. Miller 'a verilir.

Bu protokoller ve çalışmalar Cincinnati Üniversitesi 'nde (Federal kapsamlı güvence #00003152, ıRB protokol 2016-4183) Kurumsal Inceleme Kurulu tarafından gözden geçirildi ve onaylanmıştır. Tükürük dokusu yaygın olarak birçok baş ve boyun cerrahi prosedürlerinde rezeke edilir ve genellikle malign süreç tarafından yer almaz. Genellikle, hasta (Şekil 1a) kaldırıldıktan sonra 2-4 h içinde taze rezeke tükürük bezi dokusu kullanılır.
1. r...

<ol>
	<li>Kessler, A. T., Bhatt, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Major+and+Minor+Salivary+Glands,+Part+1:+Anatomy,+Infectious,+and+Inflammatory+Processes.">Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes.</a> Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).</li><li>Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Biogenesis+and+Regeneration+of+Salivary+Glands.">Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands.</a> Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).</li><li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+Treatment+of+the+Consequences+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 213-225 (2003).</li><li>Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Main+Oral+Manifestations+in+Immune-Mediated+and+Inflammatory+Rheumatic+Diseases.">Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases.</a> Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).</li><li>Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-year+observation+of+patients+with+primary+Sj&#246;gren's+syndrome:+Initial+presenting+characteristics+and+the+associated+outcomes.">Ten-year observation of patients with primary Sj&#246;gren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes.</a> International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).</li><li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+A+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review.</a> Cancer. 107, 2525-2534 (2006).</li><li>Morrison, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+cell+model+for+the+study+of+human+cytomegalovirus+replication+and+spread+within+salivary+epithelium.">Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium.</a> Journal of Virology. , (2018).</li><li>Pomeroy, C., Englund, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus:+epidemiology+and+infection+control.">Cytomegalovirus: epidemiology and infection control.</a> American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).</li><li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+In+Vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals.">Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).</li><li>Varghese, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+cell+aggregates+are+derived+from+self-organization+of+acinar+lineage+cells.">Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells.</a> Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).</li><li>Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+human+and+mouse+salivary+glands:+A+practice+guide+for+salivary+researchers.">Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers.</a> Oral Diseases. , (2018).</li><li>Lin, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+the+human+salivary+gland+HSG+cell+line+with+HeLa+cells:+A+STR+analysis+study.">Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study.</a> Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).</li><li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Polarized+Human+Salivary+Epithelial+Cells+for+Use+in+Developing+an+Artificial+Salivary+Gland.">Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland.</a> Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Salivary+Gland+Stem+Cells.">Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Primary+Epithelial+Cells+Derived+from+Human+Salivary+Gland+Contributing+to+in+vivo+Formation+of+Acini-like+Structures.">Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures.</a> Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).</li><li>Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 199-212 (2003).</li><li>Cannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+measures+study+of+weekly+and+daily+cytomegalovirus+shedding+patterns+in+saliva+and+urine+of+healthy+cytomegalovirus-seropositive+children.">Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children.</a> BMC Infect. Dis. 14, (2014).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Salivary+Gland+Stem+Cells+Functionally+Restore+Radiation+Damaged+Salivary+Glands:+Hyposalivation+Cell+Therapy.">Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy.</a> STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).</li><li>Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+improves+functional+properties+of+human+submandibular+salivary+gland+cell+line.">Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43, 622-631 (2011).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture:+Differentiation+of+Salivary+Stem/Progenitor+Cells.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).</li><li>Foraida, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization.">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li></ol>

Tükürük disfonksiyon, Sjögren sendromundan muzdarip olanlar için yaşam kalitesinin yanı sıra tükürük bezlerine bitişik kanserler için radyasyon terapisi3,4,5, 16 yaşında. Bu hastalar tedavi etmek için bir önerilen terapi fonksiyonel tükürük kök hücreleri veya organoids içinde vitro, daha sonra etkilenen doku9yerine hasarlı tükürük bezi içine ...

Memelilerde, tükürük bezleri 3 çift büyük tükürük bezi halinde düzenlenmiştir: parotis, submandibular ve dil altı bezleri. Ayrıca dilde bulunan ve ağız boşluğu boyunca dağınık küçük bezleri bir dizi var1. Büyük bezleri üretilen tükürük toplu hacminin sorumludur2. Salgılanmış faktörler aracılığıyla antimikrobiyal koruma sağlamaya ek olarak, tükürük, özofagus2' den geçerken gıda çiğneme ve yağlama sürecinde önemlidir. Bu nedenle, tükürük bezi disfonksiyon yeterli tükürük üretmek mümkün olmayan hastalarında diş boşlukları veya oral kandidiyasis3gibi maladies gelişmekte daha eğilimli olduğu bir tıbbi sorunu temsil eder. Ayrıca, düşük tükürük sonuçları yaşam kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip yemek ve sindirme daha fazla zorluk.
Tükürük bezi disfonksiyon öncelikle Sjögren sendromu muzdarip hastalarda bulunur, otoimmün bozukluk, ya da ışınlama terapisi geçirmiş olan baş ve boyun kanseri olan hastalarda3,4,5, 6' ya kadar. Otoimmünite veya radyasyon tedavisinin bir sonucu olarak bezler içinde hasarlı salgını acini kendi kendine yenilenmez, bu da geri dönüşümsüz hasar6ile yaşayan bir hasta ile sonuçlanır. Tükürük bezleri çalışma da dikkat veya viral patogenezi mekanizmaları ile ilgilenen araştırmacılar topladı. İnsan sitomegalovirüs (HCMV) gibi bazı patojenler, daha sonra tükürük7,8üzerinden yeni bir ana bilgisayara doğmakta olan virüsü iletimi için izin veren tükürük bezleri içinde ısrarla çoğaltır. Böylece, çeşitli tıbbi sorunları çözmek ve anlamak için tükürük bezi dokusunun sağlam ve tekrarlanabilir in vitro modellerini geliştirmek için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.
Murine tükürük bezi sisteminin birkaç modeli, tükürük bezlerini oluşturacak farklı epitelyal hücreleri anlamak ve karakterize etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır9,10. İnsan ve murine tükürük bezleri arasında açık ve önemli farklar var11. Fare submandibular ve parotis boyutu1,2,11çok benzer iken en önemlisi insan parotis bezi submandibular bezi ile ilgili olarak daha büyük. Ölümsüzleştirilmiş insan submandibular hücre hatları var iken, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin doğru birincil doku ve ikincil endişeleri fenotipi korumak değil büyük endişeleri vardır ölümsüzleştirilmiş hücreler aslında türetilmemiş tükürük epitelin kendisi12. Bu nedenlerle bir ilgi ve insanlardan birincil tükürük dokusu çalışması için bir ihtiyaç vardır.
Burada, primer epitelyal hücreleri doku kültürü için insan tükürük bezlerinden yalıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Protokollerimiz Pringle ve al. ve Tran ve Al 'ın eserlerine dayanmaktadır. genellikle prosedürlerini kolaylaştırmak için yapılan değişikliklerle13,14. İlk olarak, Tran ve al. ' nin Protokolü, tükürük dokusunu enzikatik olarak sindirmek için uzun bir beş saatlik kuluçka çağrısı yaparken, modifiye protokolüm, Pringle ve Al 'da benzer şekilde bir saatlik kuluçka gibi az başarılı olmuştur. İkinci olarak, doku sindirimi için farklı enzimler kullanıyoruz, özellikle de orijinal Tran ve el protokolünde kullanılan tripsin kullanmayın, ancak bunun yerine dispaz ve collagenase karışımı kullanın. Biz yeni bir çalışma olarak ilk sindirim adımlarında tripsin önlemek için tercih düşük hücre viability tripsin sonuçları tarafından tükürük dokusunun ilk sindirim, muhtemelen nadir bir kök hücre nüfus kaybı tarafından önerilen15. Son olarak, biz kültür Bodrum membran matris (BMM) yüzeyinde salispheres aslen bronş epitelyal hücrelerin yayılması için formüle ticari olarak kullanılabilen bir medya kullanarak. Protokollerimiz, parotis, submandibular ve altdilde bezlerden gelen tükürük hücrelerini izole etmek için kullanılabilir. Bu hücreler, tükürük asiner epitelyal hücrelerine benzer bir fenotip bulundurduğunu gösteren tükürük amilaz ve diğer tükürük spesifik genlerini ifade ederler7. Bu metodolojisi kullanarak > 50 primer insan dokusu örneklerinden tükürük kültürlerini başarıyla üretiyoruz. Dahası, birincil tükürük hücreleri kolayca daha sonraki bir tarihte kullanılmak üzere kriokonservirovannogo olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">100 mm culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Bronchial Epithelial Cell Growth Media</td>
			<td style="width:132px;">Lonza</td>
			<td style="width:123px;">CC-3171</td>
			<td>Add bullet kit as per manufacturer&#39;s instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cell strainer 70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Charcoal stripped fetal bovine serum</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">12676-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Collagenase type III</td>
			<td style="width:132px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004182</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cryogenic Tube</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dispase</td>
			<td style="width:132px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">07923</td>
			<td>Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dulbecco phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">55-031-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">General Chemicals</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">PathClear Basement membrane extract</td>
			<td style="width:132px;">Cultrex</td>
			<td style="width:123px;">3432-005-01</td>
			<td>Thaw at 4 &#176;C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Six-well culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-079-742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers

Tükürük bezleri insan hastalığının birden fazla yönü ile ilgilenen araştırmacılar için önemli bir ilgi alanı vardır. Araştırmacıların bir amacı, Radyasyon terapileri veya Sjögren sendromu ile ilişkili patolojiler nedeniyle hasar görmüş bezlerin fonksiyonunu geri yüklemek. Araştırmacıların ikinci hedefi, virüslerin glandüler doku içinde çoğaldığı mekanizmaları tanımlamaktır, böylece yatay iletim için önemli olan tükürük sıvılarına erişim sağlayabilirler. Bu hedefler yukarıda bahsedilen yanı sıra ilgili araştırma alanları ile ilgilenen araştırmacılar tarafından kullanılabilecek sağlam ve erişilebilir bir in vitro tükürük bezi modeli için ihtiyaç vurgulayın. Burada, epitelyal hücreleri insan tükürük bezlerinden yalıtmak ve onları in vitro yaymak için basit bir protokol tartışıyoruz. Protokollerimiz, bireysel çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için daha da optimize edilebilir. Kısaca, tükürük dokusu mekanik ve enzince tek hücreleri veya hücrelerin küçük kümeleri yalıtmak için ayrılır. Epitelyal hücreler için seçim, epitelyal hücre büyümesini teşvik etmek için optimize edilmiş medyanın varlığında bir Bodrum membran matrisinin üzerine kaplamadan oluşur. Bu ortaya çıkan kültürler üç boyutlu kümeleri olarak muhafaza edilebilir, "salispheres" olarak adlandırılan, ya da tedavi plastik doku kültürü yemekleri bir tek tabakalı olarak büyüdü. Bu protokol, hücresel senescence yapmadan önce 5-8 pasajlar (15-20 nüfus doublings) için yayılabilir ağırlıklı olarak epitelyal hücrelerin heterojen bir nüfusun gelişmesinde sonuçlanır.

İki-üç gün sonra BMM üzerine sindirilmiş doku hücreleri kaplama, hücreler kolayca küme başına 15-20 hücre boyutuna kadar genişletmek için devam edecek küçük kümeleri oluşturacak (Şekil 2a). Hücresel enkaz ve müstakil ölü hücreler genellikle görülür ve taze medya ile duman çekiş ve yenileyici tarafından kaldırılması gerekir. Hücreler yaklaşık 3-10 gün boyunca salispheres olarak çoğalırlar devam edecektir, ya da sürece ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Birincil insan tükürük bezi türevi epitelyal hücreleri izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu hücreler onları tükürük epitelyal orijinli olmak ile tutarlı gen ifade desenleri sergiler ve Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücrelerinden türetilen Bodrum membran matrisleri üzerinde salispheres olarak veya tedavi kültür yemekleri monolayers olarak yetişebilir.

Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Birincil hücresel modeller veya organoid benzeri yapılar üretmek biyolojideki birçok güncel soruyu yanıtlamanın anahtarıdır. Örneğin, yatay iletim için önemli bir site olduğu gibi tükürük bezi çoğaltma kolaylaştırmak için insan virüsleri tarafından kullanılan mekanizmalar oldukça uzun bir süre ilgi oldum. Bu protokolde tanımlanan salya temelli sistemin gelişimi, bu tür sorulara cevap verme arayışımızda çok önemli bir ilerlemedir.Bu teknik bize farklı hasta örnekleri çeşitli birincil hücreleri oluşturmak için izin verir. Hücreler in vitro deneyler için yaygın olarak kullanılan birçok hücre tipi gibi modellenmiş veya dönüştürülmüş değil gibi hücresel modeller in vivo tipi durumu daha anımsatır. Bu protokolü fare nin birincil submandibular bezinden benzer hücreler üretmek için kullandık ve protokol benzer hücresel yapılara sahip diğer organlar için de yararlı olacaktır.Hastadan alındıktan sonra 2-4 saat içinde, bir kültür plakası üzerinde, otoklavlı sterildiksiyon makası ve cerrahi forceps kullanarak tükürük bezi dokusunu 1-2 milimetre büyüklüğünde ince parçalara ayırın. Kıyma doku dispase / Kollajenaz çözeltisi altı mililitre ekleyin. Sonra 37 derecede yaklaşık 30 dakika ile bir saat arasında kuluçkaya yat.Beş mililitrelik serolojik pipet ile 15-20 kez pipetleme ile dokuyu bozun. 37 derecede 30 dakika ile bir saat arasında kuluçkaya yat. Pipetleme ve kuluçka adımını 2-3 kez daha veya doku bir bulamaç benzeyene ve pipet açıklığından kolayca geçene kadar tekrarlayın.BMM ile kuyukaplamak için, yavaş yavaş pipet 500 mikrolitre gecede çözülmüş BMM altı kuyu nun her kuyuiçine. BmM'i kuyuların üzerine eşit olarak dağıtmak için plakayı yavaşça döndürün. Daha sonra bmm katılaşmak için izin kullanmadan önce en az 15 dakika boyunca 37 santigrat derece de kaplamalı plakalar kuluçka.İlk olarak, homojendoku içeren Dispase/Kollajenaz çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri konik tüpe aktarmak için altı mililitre DPBS ile plakanın duvarını bir kez yıkayın. Sonra 70 mikrometre naylon örgü hücre süzgeci ile, sindirilmemiş doku kaldırmak için yeni bir 50 mililitre konik tüp içine homojen filtre.Santrifüj 500 kez g beş dakika boyunca hücreleri gergin. Süpernatant aspire. Daha sonra hücre peletini 1X RBC lysis tamponunun 10 mililitresinde yeniden askıya alın.37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yat. Daha sonra RBC lysis tampon nötralize etmek ve tükürük hücrelerinin lysis en aza indirmek için DPBS 20 ila 25 mililitre ekleyin. 500 kez g beş dakika santrifüj.Beyaz hücreli pelet tüm RBC'nin tam bir lizini gösterir. Pelet kırmızı renktedir, RBC lysis tamponu ile tedaviyi tekrarlayın. Supernatant aspire ve BEGM bir ila iki mililitre pelet resuspend ve daha sonra BMM kaplı kuyular üzerine resuspended hücreleri aktarın.37 santigrat derecede kuluçkaya yat. BmM'e bulaştığında hücreler iki ila üç günlük bir süre içinde küresel yapılara veya salyalara dönüşürler. Hücreler, BMM'in hücrelere erişmesine ve plastiğe yapışmasına ve tek katmanlı olarak büyümesine izin vererek bozulmaya başlamasından önce yaklaşık beş ila yedi gün boyunca salya olarak tutulabilir.İlk olarak, kuyulardan medya aspire ve her kuyu ya Dispase / Kollajenaz çözeltisi bir mililitre ekleyin. Yaklaşık 15 dakika veya BMM çoğunlukla eriyene kadar 37 santigrat derecede kuluçka. Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve kalan hücreleri elde etmek için bir ila üç mililitre DPBS ile kuyuları yıkayın.500 kez g beş dakika santrifüj. Supernatant aspire ve Trypsin iki mililitre pelet resuspend. 15 dakika boyunca 37 derecede tekrar kuluçkaya yat.Daha sonra, Trypsin nötralize etmek için% 10 serum içeren herhangi bir tam medya tüp ekleyin. 500 kez g beş dakika santrifüj. Artık ortam, Tripsin ve serumu çıkarmak ve DPBS'deki hücreleri yeniden askıya almak için süpernatantı aspire edin.500 kez g beş dakika santrifüj. Supernatant aspire ve BEGM pelet resuspend. Peletküre olarak korumak için, katılaşmış BMM kaplı kültür yemekleri üzerine resuspended hücreleri plaka.Kültür nemlendirilmiş bir kuluçka makinesindeki tüm hücreler 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile beş ila yedi gün önce subculturing ile muhafaza. Her 2-3 günde bir taze BEGM ile besleyin. Hücreleri plastik kültür tabaklarına tek katmanlı olarak çoğaltmak için, BEGM ortamını yemekten aspire edin ve artık ortamı kaldırmak için bir kez DBPS ile yıkayın.15 dakika veya hücreler tamamen ayrılmış olana kadar 37 santigrat derece iki mililitre tripsin ve kuluçka ekleyin. % 10 serum içeren herhangi bir tam medya dört mililitre kullanarak Tripsin nötralize. Sonra yavaşça çanak eğmek ve 15 mililitrekonik tüp hücreleri aktarın.Kalan hücreleri toplamak için yaklaşık beş mililitre DPBS ile plakayı bir kez yıkayın. 500 kez g beş dakika santrifüj. Süpernatant aspire.Kalan ortamları kaldırmak için, altı ila 10 mililitre DPBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. 500 kez g beş dakika santrifüj. BeGM'de supernatant'ı aspire edin ve yeniden askıya alın.Sonra tedavi plastik doku kültür yemekleri üzerine hücreleri plaka. Kültür nemlendirilmiş bir kuluçka makinesindeki hücreler, subküle atılından beş ila yedi gün önce %5 karbondioksitle 37 derecede muhafaza edilir. Her 2-3 günde bir taze BEGM ile besleyin.Bu protokolde, sindirilmiş dokudaki hücreleri 2-3 gün bmm'e kaplamasından sonra, hücreler küme başına 15 ila 20 hücreye kadar boyut genişletmeye devam eden küçük kümeler oluşturdular. Salya hücreleri hücre kültürlü işlenmiş plastik üzerine kaplanmış ve epitel kökenli hücreler ile tutarlı morfolojisi sergileyen bir monolayer olarak yetiştirilen. Bakteriyel veya mantar kontaminasyonunu önlemek için uygun aseptik teknik ve bakıma ihtiyaç vardır.Antibiyotik veya antimikotik hiçbir miktar mikroplar ile dolu bir kültür kaydedecektir. Viral patogenez ve bulaşma ile ilgili soruları yanıtlıyoruz. Ama diğerleri için, bu doku rejenerasyon tedavileri gibi uygulamaların herhangi bir sayı için insan tükürük hücreleri çalışma için bir yol sağlar.İnsan Cytomegalovirüs çalışma bizim için, bu teknik bize virüs enfekte ve sonuçta yeni konaklara iletmek için kullandığı moleküler mekanizmaları keşfetmeye başlamak için izin verdi. Bu protokolde kullanılan hiçbir şey doğal olarak tehlikeli değildir ancak insan dokusu nu ve her türlü kimyasal reaktifi kullanırken her zaman dikkatli olunmalıdır.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama&#39;yı Tedbir

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...