Name: semi-automatic pd-l1 characterization and enumeration of circulating tumor cells from non-small cell lung cancer patients by immunofluorescence
Uploaded: 2019-08-14T14:30:00
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Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche d'AstraZeneca (Londres, Royaume-Uni), Biolidics (Singapour) et la Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, France). Les auteurs remercient les entreprises AstraZeneca et Biolidics pour leur soutien financier.

Des échantillons ont été prélevés de façon prospective dans le cadre de la cohorte CIRCAN (CIRculating CANcer) basée au CHU de Lyon après le consentement écrit du patient. Cette étude a été intégrée à la cohorte CIRCAN-ALL. L'étude CIRCAN-ALL a été reconnue comme non interventionnelle par le RPC Sud-Est IV daté du 04/11/2015 en vertu de la référence L15-188. Une version modifiée a été reconnue comme non interventionnelle le 20/09/2016 en vertu de la référence L16-160. L'étude CIRCAN-ALL a été...

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	<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+in+Metastatic+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).</li><li>Paz-Ares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+for+Squamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).</li><li>Langer, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+validation+of+an+ultra+high-throughput+spiral+microfluidics+for+the+detection+and+enrichment+of+viable+circulating+tumor+cells.">Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells.</a> PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).</li><li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma:+Comparison+among+cytology,+small+biopsy,+and+surgical+resection+specimens.">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li><li>Biswas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+performance+of+endobronchial+ultrasound-guided+transbronchial+needle+aspiration+for+assessing+programmed+death+ligand-1+expression+in+nonsmall+cell+lung+cancer.">Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer.</a> Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).</li><li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing:+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li></ol>

Deux points majeurs ont été soulevés dans la présente étude, le premier en ce qui concerne la performance du flux de travail pour son transfert à des applications cliniques, et le second concernant la diminution de la subjectivité pour l'analyse des images de fluorescence obtenues.
Un flux de travail performant et optimisé pour l'énumération de la CCT a d'abord été déterminé à l'aide d'un analyse FI personnalisable après enrichissement cellulaire par l'intermédiaire d'un syst?...

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques à l'antigène tumoral jouent un rôle crucial dans la réponse aux cancers par le biais d'un processus connu sous le nom de « surveillance immunitaire » du cancer. Leurs fonctions antitumorales sont renforcées par des anticorps de blocus de point de contrôle immunitaire tels que les inhibiteurs cTLA-4 et les inhibiteurs De PD-1/PD-L1. Dans le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC), les thérapies anti-PD-1/PD-L1 ont comme conséquence des taux de réponse s'étendant de 0%-17% dans les patients présentant des tumeurs PD-L1-négatives et 36%-100% dans ceux exprimant PD-L1. Les réponses robustes au blocus de PD-1/PD-L1 observées dans le mélanome et NSCLC sont montrées par l'évidence du taux global amélioré de réponse (RR), des avantages cliniques durables, et de la survie sans progression (PFS). À l'heure actuelle, les traitements anti-PD1 sont la norme de soins dans le traitement de deuxième intention avec le nivolumab indépendamment de l'expression PD-L1 et avec le pembrolizumab chez les patients exprimant PD-L1 -1%. Dans le traitement de première ligne, la norme de soins est le pembrolizumab seul chez les patients atteints de NSCLC exprimant PD-L1 50% et peut être potentiellement améliorée avec la chimiothérapie (platin et médicament doublet selon le sous-type histologique)1,2.
Cependant, une telle approche à lagestion patiente est discutable 3, puisque l'expression de PD-L1 dans les cellules de tumeur par immunohistochemistry (IHC) n'est probablement pas le biomarqueur de compagnon le plus idéal. D'autres tels que la charge de mutation de tumeur4 (TMB), l'instabilité de microsatellite (MSI), et/ou le microbiote sont probablement intéressants dans ce arrangement seul ou en combinaison. NSCLC sont connus pour être des tumeurs hétérogènes, soit spatialement (d'un site de tumeur à un autre) ou temporellement (du diagnostic à la répétition). Les patients atteints de NSCLC sont généralement fragiles, et les biopsies invasives itératives de tissu peuvent être un problème. En effet, le taux de rebiopsie à la première progression varie de 46% à 84% selon les séries, et la re-biopsie réussie (c'est-à-dire avec une analyse histologique et moléculaire complète) varie de 33% à 75%. Cela signifie que 25%-67% des patients ne peuvent pas recevoir une analyse complète de re-biopsie au cours de la première progression5,6,7,8.
L'avènement des « biopsies liquides » a ainsi suscité un enthousiasme considérable dans ce contexte particulier, car il permet une réévaluation cruciale des altérations moléculaires lors de la progression de la maladie en examinant l'ADN libre circulant (aDNc) dérivé de la circulation cellules tumorales (CTC). Ces cellules vivantes sont libérées de la tumeur dans la circulation sanguine, où elles circulent librement. Bien qu'elle ne soit pas couramment utilisée, l'analyse des CCT semble très prometteuse dans le cas de la caractérisation moléculaire et phénotypique, du pronostic et de l'importance prédictive dans le cancer du poumon (via DNAseq, RNAseq, miRNA et analyse des protéines). En effet, les CTC abritent probablement des caractéristiques phénotypiques de la maladie active plutôt que les marqueurs initiaux (détectés sur les biopsies tissulaires au moment du diagnostic). En outre, les CTC détournent le problème de l'hétérogénéité spatiale du tissu tumoral, qui peut être un problème crucial dans de petites biopsies. Par conséquent, l'expression de PD-L1 sur des CTC peut potentiellement jeter la lumière sur les écarts dérivés de son utilisation comme biomarqueur prédictif utilisant le tissu de tumeur.
Récemment, l'expression PD-L1 a été testée dans les CCT de NSCLC. Presque tous les patients examinés9 étaient Positifs de PD-L1, compliquant l'interprétation du résultat et de son utilisation clinique. Dans l'ensemble, des CTC positifs au PD-L1 ont été détectés dans 69,4 % des échantillons provenant d'une moyenne de 4,5 cellules/mL10. Après l'initiation de la radiothérapie, la proportion de CTC PD-L1-positifs a augmenté de manière significative, indiquant la régulation vers le haut de l'expression de PD-L1 en réponse au rayonnement11. Par conséquent, l'analyse de CTC de PD-L1 peut être employée pour surveiller des changements dynamiques de la tumeur et de la réponse immunitaire, qui peuvent refléter la réponse à la chimiothérapie, à la radiothérapie, et aux traitements probables d'immunothérapie (IT).
À ce jour, l'isolement des CCT et la caractérisation de la DPc-L1 s'appuient sur diverses méthodes telles que lacapture de perles magnétiques à base de perles magnétiques anti-EpCAM, l'analyse basée sans enrichissement et la taille 12,13 essais de capture de la CCT. Cependant, les CTC n'ont été détectés que chez 45 à 65 % des patients atteints de NSCLC métastatique, ce qui limite leur capacité de fournir des renseignements à plus de la moitié des patients atteints de NSCLC métastatique. De plus, le nombre de CCT était faible dans la plupart de ces études en utilisant l'approche fondée sur la taille10. En outre, cette méthode a conduit à des divergences telles que la détection de cellules CD45(-)/DAPI(MD) avec des « modèles cytomorphologiques de malignité » dans la circulation sanguine de donneurs en bonne santé. Ces préoccupations soulignent la nécessité d'une méthode très sensible de collecte de la CCT associée au phénotypage immunitaire des cellules CD45(-) atypiques provenant de sang entier sain à l'aide de biomarqueurs du cancer supplémentaires (c.-à-d. TTF1, Vimentin, EpCAM et CD44) dans le NSCLC.
Par conséquent, nous avons évalué un dispositif microfluidique en spirale qui utilise des forces de traînée inertielles et dedoyen pour séparer les cellules en fonction de la taille et de la plasticité à l'intermédiaire d'une puce microfluidique. La formation des flux de vortex Dean présents dans la puce microfluidique donne lieu à de plus grandes CTC situées le long de la paroi intérieure et à de plus petites cellules immunitaires le long de la paroi extérieure de la puce. Le processus d'enrichissement est complété par le siphonnage des cellules plus grandes dans la prise de collecte comme la fraction de la CCT enrichie. Cette méthode est particulièrement sensible et spécifique (détection d'environ 1 CTC/mL de sang entier)14 et peut être associée à des analyses personnalisées d'immunofluorescence (IF). Ces outils permettront de mettre en place un seuil positif pour l'interprétation clinique. Un flux de travail est ainsi décrit qui permet aux biologistes d'isoler et d'immunophénotype CTC avec un taux élevé de récupération et de spécificité. Le protocole décrit l'utilisation optimale de l'appareil microfluidique en spirale pour recueillir les CTC, les tests IF optimisés qui peuvent être personnalisés selon le type de cancer, et l'utilisation de logiciels libres open-source pour mesurer et analyser les images cellulaires pour effectuer un semi-automatique numération des cellules en fonction de la coloration fluorescente. En outre, le multiplexage au microscope peut être effectué en fonction du nombre de filtres fluorescents/marqueurs disponibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1004px;" width="1004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:148px;">Ozyme</td>
			<td style="width:105px;">BLE 422801</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">BD Facs Clean &#8211; 5L</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">340345</td>
			<td style="width:375px;">Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016012</td>
			<td style="width:375px;">Bleach. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">A8412</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:105px;">BLE304020</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">CellProfiler Software</td>
			<td style="width:148px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:375px;">Image Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge device</td>
			<td style="width:148px;">Hettich</td>
			<td style="width:105px;">4706</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:105px;">430-829</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge Tube 15 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F001004-25</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">ClearCell FX-1 System</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F011002</td>
			<td style="width:375px;">Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">Coulter Clenz Cleaning Agent &#8211; 5L</td>
			<td style="width:148px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:105px;">8448222</td>
			<td style="width:375px;">All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">CTChip FR1S</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-FR001002</td>
			<td style="width:375px;">Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Cytospin 4</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78300003</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Diluent Additive Reagent &#8211; 20 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016009</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">EZ Cytofunnels</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78710003</td>
			<td style="width:375px;">Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">FcR blocking Agent</td>
			<td style="width:148px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:105px;">130-059-901</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:148px;">Gibco</td>
			<td style="width:105px;">10270-106</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">F4680</td>
			<td style="width:375px;">Mounting solution. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fungizone - 50 mg</td>
			<td style="width:148px;">Bristol-Myers-Squibb</td>
			<td style="width:105px;">90129TB29</td>
			<td style="width:375px;">Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">FX1 Input Straw with lock cap</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F013005</td>
			<td style="width:375px;">Straw. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">KovaSlide</td>
			<td style="width:148px;">Dutscher</td>
			<td style="width:105px;">50126</td>
			<td style="width:375px;">Chambered slide. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">53-9003-80</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">11490570</td>
			<td style="width:375px;">Fixation solution. Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:105px;">BLE329706</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:148px;">Dutscher</td>
			<td style="width:105px;">632180</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:148px;">Ozyme</td>
			<td style="width:105px;">BE17-512F</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X &#8211; 1L</td>
			<td style="width:148px;">1st Base Laboratory</td>
			<td style="width:105px;">BUF-2040-1X1L</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Pluronic F-68 10%</td>
			<td style="width:148px;">Gibco</td>
			<td style="width:105px;">24040-032</td>
			<td style="width:375px;">Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Polylysine slides</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Polypropylene Conical Tube 50 mL</td>
			<td style="width:148px;">Falcon</td>
			<td style="width:105px;">352098</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">RBC Lysis Buffer &#8211; 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">G Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">786-649</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">RBC Lysis Buffer &#8211; 250 mL</td>
			<td style="width:148px;">G Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">786-650</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Resuspension Buffer (RSB)</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016003</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Shandon Cytopsin4 centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78300003</td>
			<td style="width:375px;">Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Silicon Isolator</td>
			<td style="width:148px;">Grace bio-Labs</td>
			<td style="width:105px;">664270</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Sterile Deionized Water &#8211; 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">1st Base Laboratory</td>
			<td style="width:105px;">CUS-4100-100ml</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1</td>
			<td style="width:148px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Surgical Sterile Bag</td>
			<td style="width:148px;">SPS Laboratoires</td>
			<td style="width:105px;">98ULT01240</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Syringe BD Discardit II 20 mL sterile</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">300296</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Syringe Filter 0.22 &#181;m 33 mm sterile</td>
			<td style="width:148px;">ClearLine</td>
			<td style="width:105px;">51732</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Zen lite 2.3 Lite Software</td>
			<td style="width:148px;">Zeiss</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:375px;">Microscope associated software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automatic pd-l1 characterization and enumeration of circulating tumor cells from non-small cell lung cancer patients by immunofluorescence

Les cellules tumorales circulantes (CTC) dérivées de la tumeur primaire sont jetées dans la circulation sanguine ou le système lymphatique. Ces cellules rares (1 à 10 cellules par ml de sang) justifient un mauvais pronostic et sont corrélées avec une survie globale plus courte dans plusieurs cancers (p. ex. le sein, la prostate et le cancer colorectal). À l'heure actuelle, le système de capture à base de perles magnétiques anti-EpCAM est le test de référence approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l'énumération des CCT dans la circulation sanguine. Ce test est basé sur l'utilisation de perles magnétiques recouvertes de marqueurs anti-EpCAM, qui ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses épithéliales. De nombreuses études ont montré qu'EpCAM n'est pas le marqueur optimal pour la détection de la CCT. En effet, les CTC sont une sous-population hétérogène de cellules cancéreuses et sont capables de subir une transition épithéliale à mésenchymale (EMT) associée à la prolifération métastatique et à l'invasion. Ces CTC sont capables de réduire l'expression du marqueur épithélial de surface cellulaire EpCAM, tout en augmentant les marqueurs mésenchymal tels que la vimentine. Pour surmonter cet obstacle technique, d'autres méthodes d'isolement fondées sur les propriétés physiques des CCT ont été mises au point. Les technologies microfluidiques permettent une approche sans étiquette de l'enrichissement de la CCT à partir d'échantillons de sang entier. La technologie microfluidique spirale utilise les forces de traînée inertielles et Dean avec un flux continu dans les canaux incurvés générés dans une puce microfluidique spirale. Les cellules sont séparées en fonction des différences de taille et de plasticité entre les cellules sanguines normales et les cellules tumorales. Ce protocole détaille les différentes étapes pour caractériser l'expression programmée de la ligand de la mort 1 (PD-L1) des CTC, combinant un dispositif microfluidique en spirale avec l'ensemble de marqueurs d'immunofluorescence personnalisable (IF).

La première condition préalable était d'obtenir des collections non contaminées (sans agent infectieux) de CTC pour la culture tissulaire et d'éviter les antécédents de FI générés. Le protocole de décontamination a permis le nettoyage de tous les tuyaux et pompes, et il a abouti à la collecte des CTC avec un bon taux de récupération sans contamination bactérienne. Les échantillons enrichis ont été comparés sans et avec le flux de travail de protocole de décontamination du dispositif microfluidique en ...

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Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

La caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) est un sujet populaire dans la recherche translationnelle. Ce protocole décrit un test semi-automatique d'immunofluorescence (IF) pour la caractérisation de PD-L1 et l'énumération des CTC dans les échantillons patients de cancer de poumon de non-petite cellule (NSCLC).

Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

D’après la technologie microfluidique, l’isolement et la caractérisation des CTC à partir des cellules sanguines normales ne nécessitent pas l’utilisation de biomarqueurs spécifiques de la CCT et sont compatibles avec la culture cellulaire. Ce protocole facilite un taux élevé d’extraction de la CCT et fournit une analyse cytologique approfondie des CTC, en évaluant les caractéristiques cytomorphologiques malignes. L’expression pd-L1 par les CTC a une valeur prédictive dans la gestion du cancer du poumon.L’amélioration de sa détection à l’aide de ce test pourrait favoriser une meilleure prise en charge des patients à long terme. D’autres applications de ce protocole incluent la détection d’aberrations génétiques à l’aide de FISH, ou la réalisation d’analyses transcriptomiques sur les CTC, ainsi que l’isolement des cellules d’origine fœtale chez les mères. Julie Balandier, technicienne de notre laboratoire, démontrera la procédure.Pour l’enrichissement pré-analytique de cellules tumorales circulant, recueillez d’abord 7,5 millilitres de sang dans un tube EDTA de potassium, et gardez l’échantillon sous agitation douce pour éviter la sédimentation cellulaire et la coagulation. Dans les six heures suivant la collecte, utilisez une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique, pour transférer jusqu’à 7,5 millilitres de sang entier dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 millilitres et centrifugez l’échantillon pendant 10 minutes à 1600 fois G, à température ambiante. À la fin de la centrifugation, utiliser une pipette de transfert pour recueillir la fraction plasmatique sans déranger la couche buffy, et diluer le plasma avec un volume équivalent de PBS, jusqu’à 7,5 millilitres.Ensuite, ajoutez soigneusement le tampon de lyse des globules rouges à l’échantillon de sang, à un volume final de 30 millilitres, et inversez doucement le tube de collecte de sang trois fois, avant de placer le tube à température ambiante pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation, et retirer soigneusement tous sauf les quatre à cinq derniers millilitres de supernatant. Utilisez une micropipette filtrée pour enlever le supernatant restant et utilisez une micropipette P1000 avec une pointe filtrée pour ajouter un millilitre de tampon de resuspension sur la paroi du tube.Pour éviter d’introduire des bulles, resuspendez la pastille cellulaire avec du pipetage doux, jusqu’à ce que l’échantillon soit homogène. Lorsque la pastille a été résuspendue, ajouter trois millilitres supplémentaires de tampon de resuspension à la paroi du tube, sans introduire de bulles, et mélanger doucement les cellules à nouveau. Pour l’enrichissement microfluidique en spirale de cellules tumorales, chargez d’abord une nouvelle puce microfluidique spirale sur l’appareil et chargez un tube de centrifugeuse vide de 50 millilitres dans chacun des ports d’entrée et de sortie.Cliquez sur premier pour amorce de l’appareil microfluidique spirale pendant trois minutes. Suppression des tubes d’entrée et de sortie à la fin du cycle. Chargez l’échantillon de sang résuspendé dans le port d’entrée et chargez un tube conique clair de 15 millilitres dans le port de sortie.Cliquez ensuite sur exécuter, et sélectionnez le programme trois pour lancer le programme d’enrichissement cellulaire tumoral circulant de 31 minutes. À la fin du cycle transférer le tube de sortie à la centrifugeuse, et utiliser une pipette sérologique de cinq millilitres pour enlever tous sauf les deux derniers millilitres du supernatant. Ensuite, utilisez une micropipette pour enlever tous sauf les 100 derniers microlitres de supernatant.Pour la coloration de l’immunofluorescence, comptez les cellules dans un hémocytomètre et diluez l’échantillon enrichi à une fois dix à cinq cellules par 100 microlitres de concentration de solution anti-liaison de 0,2 %. Ensuite, utilisez un coton-tige imbibé de 50 microlitres de solution anti-liaison pour humidifier le contour de la chambre échantillonnée, et placez une glissière en verre polylysine dans la chambre d’échantillon. Fermez la chambre, et pipette de haut en bas trois fois pour enrober une pointe de micropipette avec la solution de liaison avant de résuspendre l’échantillon dans les 100 derniers microlitres du supernatant.Transférez la solution cellulaire dans la chambre de l’échantillon et cytospinez l’échantillon dans une centrifugeuse dédiée à 400 rotations par minute pendant quatre minutes, à une faible accélération. À la fin de la centrifugation, placez un isolateur en silicone autour de la zone de dépôt et laissez sécher la glissière sous une armoire de sécurité microbiologique pendant deux minutes, puis fixez l’échantillon de cytospun avec 100 microlitres de 4 % de paraformaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante, suivis de trois lavages de deux minutes avec 200 microlitres de PBS par lavage, à température ambiante. Après le dernier lavage, bloquer toute liaison non spécifique avec incubation de 30 minutes dans le blocage du réaccente à température ambiante, suivie de l’étiquetage avec 100 microlitres de la solution anticorps d’intérêt.Placez la lame étiquetée dans une boîte de Pétri de 100 x 15 millilitres sur un morceau de papier absorbant humidifié avec deux millilitres d’eau stérile, et placez le plat fermé, à quatre degrés Celsius pendant la nuit, à l’abri de la lumière. Le lendemain matin, lavez l’échantillon trois fois avec pbs comme démontré, et montez l’échantillon avec 10 microlitres d’une solution de montage appropriée et d’un glissement de couverture en verre. Sceller ensuite le bordereau de couverture avec du vernis à ongles clair.Pour l’image des échantillons de cytospun, chargez la diapositive sur un microscope fluorescent droit avec une plate-forme motorisée X Y, et sélectionnez un objectif 20x et les canaux appropriés en fonction des fluorophores utilisés pour l’étiquetage des anticorps. Allumez la lampe au mercure et adaptez le microscope et les logiciels associés à une pousse semi-automisée. Lorsque la lampe est prête, dans le menu d’acquisition, définissez les quatre canaux, définissez le temps d’exposition et définissez les tuiles à numériser.Cliquez sur les tuiles, et l’expérience avancée, et définir la zone à numériser. Ajustez ensuite l’accent sur l’écran et cliquez sur démarrer l’expérience. À la fin de l’expérience, exportez les fichiers TIF pour chaque canal, et nommez spécifiquement le fichier pour inclure l’échantillon, le nombre de fois, le colorant et le nombre de sous-tuiles.Pour l’analyse d’images, ouvrez le logiciel d’analyse d’image à partir du site Web du Broad Institute et cliquez sur fichier, pipeline à partir du fichier et analyse de quatre canaux CTC. Déposez les fichiers dans la liste des fichiers et mettez à jour les métadonnées pour regrouper les fichiers par vignettes. Cliquez ensuite pour analyser les images pour ouvrir le fichier de feuille de calcul correspondant aux paramètres d’intensité de la mesure.Sans le protocole optimisé de décontamination, une contamination bactérienne élevée est observée dans les cultures tissulaires des lignées cellulaires A549 enrichies après seulement 24 heures, causant la mort et des changements cytomorphologiques dans les cellules eucaryotes. En revanche, après le protocole de nettoyage, les cellules vivantes d’A549 sont obtenues dans les cultures 2D après 10 heures de culture de tissu et d’enlèvement moyen, dans des conditions de culture 3D, et dans des échantillons de patient. À l’aide d’un test de coloration immunofluorescent liquide ou d’un test de coloration immunofluorescent sur des diapositives recouvertes de polylysine avec cytospin, une distinction claire dans le nombre de noyaux énumérés entre les deux analyses peut être observée.Sans l’étape de cytospin, il est difficile de différencier les globules blancs des cellules de tumeur, en raison des contours flous dans les préparations de cellules non-cytospin. Ici, différents résultats représentatifs de différents échantillons de patients peuvent être observés, avec le nombre résiduel des globules blancs en particulier déterminé pour être fortement variable, et dépendant de l’échantillon de sang entier. Une variabilité élevée a été également observée dans les sous-populations circulantes de cellules de tumeur obtenues.Chaque cellule sur le cytospin est identifiée par le logiciel d’analyse d’image, et permet le suivi des cellules et manuellement pour confirmer les résultats si nécessaire. En effet, une analyse pilote a démontré une concordance entre l’énumération manuelle et l’énumération des logiciels d’analyse d’images. La configuration de la boîte de Pétri humide conçue à l’interne pour l’hybridation protéine-anticorps est essentielle, car l’appareil reste suffisamment humide pendant toute la durée d’incubation.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Captage et sortie de Viable cellules tumorales circulantes du sang

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

La mise en place d’un essai de colonisation poumon pour la visualisation de cellules de tumeur dans les tissus pulmonaires en circulation

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caractérisation des cellules tumorales à l’aide d’un fil médical pour capturer des cellules tumorales circulantes : une approche 3D basée sur Immunofluorescence et ADN poisson

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic Transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire syngénique pour étudier l’Expression des PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation de cellules tumorales circulantes pour l’analyse moléculaire en aval et l’évaluation du potentiel métastatique

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...