Name: semi-automatic pd-l1 characterization and enumeration of circulating tumor cells from non-small cell lung cancer patients by immunofluorescence
Uploaded: 2019-08-14T14:30:00
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इस काम Astraeca (लंदन, यूनाइटेड किंगडम), Biolidics (सिंगापुर) और लीग Contre ले कैंसर (सोन एट लॉयर, फ्रांस) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकअपने वित्तीय समर्थन के लिए एस्ट्राज़ेनेका और Biolidics कंपनियों का शुक्र है.

नमूने संभावित CIRCAN के ढांचे के भीतर एकत्र किए गए थे ("CIRculating CANcer") रोगी लिखित सहमति के बाद Lyon विश्वविद्यालय अस्पताल में आधारित सहगण. इस अध्ययन CIRCAN-ALL सहगण में एकीकृत किया गया था. अध्ययन CIRCAN$ALL संदर्भ L15-188 के तहत सीपीपी ...

<ol>
	<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+in+Metastatic+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).</li><li>Paz-Ares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+for+Squamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).</li><li>Langer, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma:+Comparison+among+cytology,+small+biopsy,+and+surgical+resection+specimens.">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li><li>Biswas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+performance+of+endobronchial+ultrasound-guided+transbronchial+needle+aspiration+for+assessing+programmed+death+ligand-1+expression+in+nonsmall+cell+lung+cancer.">Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer.</a> Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).</li><li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing:+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li></ol>

दो प्रमुख अंक वर्तमान अध्ययन में उठाए गए थे, पहले के साथ नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अपने हस्तांतरण के लिए कार्यप्रवाह के प्रदर्शन का संबंध है, और दूसरा प्राप्त फ्लोरोसेंट छवियों के विश्लेषण के लिए विष...

ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट साइटोटॉक्सिक टी-लिम्फोसाइट (सीटीएल) कैंसर "प्रतिरक्षा निगरानी" के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से कैंसर की प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उनके विरोधी ट्यूमर कार्यों ऐसे CTLA-4 inhibitors और पीडी-1/PD-L1 inhibitors के रूप में प्रतिरक्षा जांच चौकी नाकाबंदी एंटीबॉडी द्वारा बढ़ाया जाता है। गैर-छोटी कोशिका फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) में, पीडी-1/पीडी-एल 1 उपचारों के परिणामस्वरूप पीडी-एल 1-नकारात्मक ट्यूमर वाले रोगियों में 0%-17% और पीडी-एल 1 व्यक्त करने वालों में 36%-100% से लेकर प्रतिक्रिया दरों में परिणाम होता है। पीडी-1/पीडी-एल 1 मेलेनोमा और NSCLC में मनाया नाकाबंदी के लिए मजबूत प्रतिक्रियाओं में सुधार समग्र प्रतिक्रिया दर (आरआर), टिकाऊ नैदानिक लाभ, और प्रगति मुक्त अस्तित्व (PFS) के सबूत द्वारा दिखाए जाते हैं. वर्तमान में, विरोधी PD1 उपचार PD-L1 अभिव्यक्ति की परवाह किए बिना और पीडी-L1 $ 1% व्यक्त रोगियों में pembrolizumab के साथ nivolumab के साथ दूसरी लाइन NSCLC उपचार में देखभाल के मानक हैं. पहली लाइन के उपचार में, देखभाल के मानक NSCLC के साथ रोगियों में अकेले pembrolizumab है पीडी-एल 1 $50% व्यक्त और संभावित रसायन चिकित्सा के साथ बढ़ाया जा सकता है (प्लेटिन और द्वि गुणिक दवा हिस्टोलॉजिक उपप्रकार के आधार पर)1,2.
हालांकि, रोगी प्रबंधन के लिए इस तरह के एक दृष्टिकोण विवादास्पद3है, के बाद से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति शायद सबसे आदर्श साथी biomarker नहीं है. ट्यूमर उत्परिवर्तन बोझ4 (TMB), microsatellite अस्थिरता (एमएसआई), और / या microbiota के रूप में दूसरों को संभवतः अकेले या संयोजन में इस सेटिंग में दिलचस्प हैं. NSCLC विषम ट्यूमर होने के लिए जाना जाता है, या तो स्थानिक (एक ट्यूमर साइट से एक दूसरे के लिए) या लौकिक (निदान से पुनरावृत्ति के लिए). NSCLC के साथ मरीजों को आम तौर पर नाजुक हैं, और आक्रामक इनवेसिव ऊतक बायोप्सी एक मुद्दा हो सकता है. दरअसल, पहली प्रगति पर फिर से बायोप्सी दर श्रृंखला के आधार पर 46%-84% से लेकर, और सफल फिर से बायोप्सी (हिस्टोलॉजिकल और पूर्ण आणविक विश्लेषण के साथ अर्थ) 33%-75% से पर्वतमाला. इसका मतलब यह है कि 25%-67% रोगियों को पहली प्रगति5,6,7,8के दौरान एक व्यापक पुन: बायोप्सी विश्लेषण प्राप्त नहीं कर सकते .
"तरल बायोप्सी" के आगमन इस प्रकार इस विशेष सेटिंग में काफी उत्साह उत्पन्न किया है, के रूप में यह रोग प्रगति के दौरान आणविक परिवर्तन के महत्वपूर्ण पुनर्मूल्यांकन में सक्षम बनाता है घूम मुक्त डीएनए (cfDNA) घूम से व्युत्पन्न की जांच करके ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी)। इन जीवित कोशिकाओं ट्यूमर से खून में जारी कर रहे हैं, जहां वे स्वतंत्र रूप से प्रसारित. हालांकि नियमित रूप से इस्तेमाल नहीं किया, CTCs के विश्लेषण के लिए आणविक और phenotypic लक्षण, पूर्वानुमान, और फेफड़ों के कैंसर में भविष्य कहनेवाला महत्व के मामले में अत्यधिक आशाजनक प्रतीत होता है (DNAseQ केमाध्यम से, RNAseQ, miRNA और प्रोटीन विश्लेषण). दरअसल, सीटीसी की संभावना प्रारंभिक मार्करों के बजाय सक्रिय रोग के phenotypic विशेषताओं बंदरगाह (निदान पर ऊतक बायोप्सी पर पता चला). इसके अलावा, सीटीसी ट्यूमर ऊतक के स्थानिक विषमता की समस्या को बाईपास करते हैं, जो छोटे बायोप्सी में एक महत्वपूर्ण मुद्दा हो सकता है। नतीजतन, सीटीसी पर पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति संभवतः ट्यूमर ऊतक का उपयोग कर एक भविष्य कहनेवाला biomarker के रूप में इसके उपयोग से प्राप्त विसंगतियों पर प्रकाश डाला जा सकता है.
हाल ही में, एनएससीएलसी के सीटीसी में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति का परीक्षण किया गया है। परीक्षणकिए गए लगभग सभी रोगी पीडी-एल 1 सकारात्मक थे, परिणाम की व्याख्या और इसके नैदानिक उपयोग को जटिल बना रहे थे। कुल मिलाकर, पीडी-एल 1 सकारात्मक सीटीसी 4.5 कोशिकाओं के एक औसत सेनमूने के 69.4% में पाया गया / विकिरण चिकित्सा की शुरुआत के बाद, पीडी-एल 1-सकारात्मक सीटीसी का अनुपात काफी बढ़ गया, जो विकिरण11के जवाब में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति के विनियमन का संकेत देता है। इसलिए, पीडी-एल 1 सीटीसी विश्लेषण का उपयोग ट्यूमर और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के गतिशील परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए किया जा सकता है, जो कीमोथेरेपी, विकिरण, और संभावित इम्यूनोथेरेपी (आईटी) उपचार की प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित कर सकता है।
तारीख करने के लिए, सीटीसी अलगाव और पीडी-L1 विशेषता इस तरह के विरोधी EpCAM लेपित चुंबकीय मनका आधारित सीटीसी पर कब्जा, संवर्धन मुक्त आधारित परख, और आकार आधारित12,13 सीटीसी कब्जा assays के रूप में विभिन्न तरीकों पर भरोसा करते हैं। तथापि, सीटीसी का केवल मेटास्टैटिक एनएससीएलसी वाले 45%-65% रोगियों में पाया गया, जिससे मेटास्टैटिक एनएससीएलसी के आधे से अधिक रोगियों के लिए कोई सूचना प्रदान करने की उनकी क्षमता सीमित हो गई। इसके अलावा, सीटीसी गिनती आकार आधारित दृष्टिकोण10का उपयोग कर इन अध्ययनों में से अधिकांश में कम था. इसके अलावा, इस विधि ने स्वस्थ दाताओं के खून में "द्रोह के cytomorphological पैटर्न" के साथ CD45(-)/DAPI(+) कोशिकाओं का पता लगाने जैसी विसंगतियों को बढ़ावा दिया है। इन चिंताओं को अतिरिक्त कैंसर biomarkers का उपयोग कर स्वस्थ पूरे रक्त से अटूट CD45 (-) कोशिकाओं की प्रतिरक्षा-phenotyping के साथ जुड़े सीटीसी संग्रह की एक अत्यधिक संवेदनशील विधि की आवश्यकता पर प्रकाश डाला (यानी, TTF1, Vimentin, EpCAM, और CD44) NSCLC में.
नतीजतन, हम एक सर्पिल microfluidic डिवाइस है कि जड़त्वका का उपयोग करता है और डीन खींचें बलों का मूल्यांकन करने के लिए एक microfluidic चिप के माध्यम से आकार और प्लास्टिक के आधार पर कोशिकाओं को अलग. डीन भंवर के गठन microfluidic चिप में मौजूद आंतरिक दीवार और चिप की बाहरी दीवार के साथ छोटे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ स्थित बड़ा सीटीसी में मौजूद बहती है. संवर्धन प्रक्रिया समृद्ध सीटीसी अंश के रूप में संग्रह आउटलेट में बड़े कोशिकाओं sphoning द्वारा पूरा किया है. यह विधि विशेष रूप से संवेदनशील और विशिष्ट है (पूरे रक्त के लगभग 1 सीटीसी/एमएल का पता लगाना)14 और अनुकूलित इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) विश्लेषण के साथ संबद्ध किया जा सकता है। इन उपकरणों नैदानिक व्याख्या के लिए एक सकारात्मक सीमा की स्थापना सक्षम हो जाएगा. एक कार्यप्रवाह इस प्रकार वर्णित है कि जीवविज्ञानियों को अलग करने और इम्यूनोफेनोटाइप CTCs वसूली और विशिष्टता की एक उच्च दर के साथ सक्षम बनाता है. प्रोटोकॉल CTCs इकट्ठा करने के लिए सर्पिल microfluidic डिवाइस के इष्टतम उपयोग का वर्णन करता है, अनुकूलित IF परख कि कैंसर के प्रकार के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है, और सेल छवियों को मापने और विश्लेषण के लिए मुक्त खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक अर्द्ध स्वचालित प्रदर्शन फ्लोरोसेंट धुंधला के अनुसार कोशिकाओं की संख्या. इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप बहुसंकेतन उपलब्ध फ्लोरोसेंट फिल्टर/मार्कर की संख्या के आधार पर किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1004px;" width="1004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:148px;">Ozyme</td>
			<td style="width:105px;">BLE 422801</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">BD Facs Clean &#8211; 5L</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">340345</td>
			<td style="width:375px;">Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016012</td>
			<td style="width:375px;">Bleach. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">A8412</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:105px;">BLE304020</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">CellProfiler Software</td>
			<td style="width:148px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:375px;">Image Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge device</td>
			<td style="width:148px;">Hettich</td>
			<td style="width:105px;">4706</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:105px;">430-829</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge Tube 15 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F001004-25</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">ClearCell FX-1 System</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F011002</td>
			<td style="width:375px;">Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">Coulter Clenz Cleaning Agent &#8211; 5L</td>
			<td style="width:148px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:105px;">8448222</td>
			<td style="width:375px;">All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">CTChip FR1S</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-FR001002</td>
			<td style="width:375px;">Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Cytospin 4</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78300003</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Diluent Additive Reagent &#8211; 20 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016009</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">EZ Cytofunnels</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78710003</td>
			<td style="width:375px;">Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">FcR blocking Agent</td>
			<td style="width:148px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:105px;">130-059-901</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:148px;">Gibco</td>
			<td style="width:105px;">10270-106</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">F4680</td>
			<td style="width:375px;">Mounting solution. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fungizone - 50 mg</td>
			<td style="width:148px;">Bristol-Myers-Squibb</td>
			<td style="width:105px;">90129TB29</td>
			<td style="width:375px;">Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">FX1 Input Straw with lock cap</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F013005</td>
			<td style="width:375px;">Straw. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">KovaSlide</td>
			<td style="width:148px;">Dutscher</td>
			<td style="width:105px;">50126</td>
			<td style="width:375px;">Chambered slide. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">53-9003-80</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">11490570</td>
			<td style="width:375px;">Fixation solution. Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:105px;">BLE329706</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:148px;">Dutscher</td>
			<td style="width:105px;">632180</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:148px;">Ozyme</td>
			<td style="width:105px;">BE17-512F</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X &#8211; 1L</td>
			<td style="width:148px;">1st Base Laboratory</td>
			<td style="width:105px;">BUF-2040-1X1L</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Pluronic F-68 10%</td>
			<td style="width:148px;">Gibco</td>
			<td style="width:105px;">24040-032</td>
			<td style="width:375px;">Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Polylysine slides</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Polypropylene Conical Tube 50 mL</td>
			<td style="width:148px;">Falcon</td>
			<td style="width:105px;">352098</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">RBC Lysis Buffer &#8211; 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">G Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">786-649</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">RBC Lysis Buffer &#8211; 250 mL</td>
			<td style="width:148px;">G Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">786-650</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Resuspension Buffer (RSB)</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016003</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Shandon Cytopsin4 centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78300003</td>
			<td style="width:375px;">Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Silicon Isolator</td>
			<td style="width:148px;">Grace bio-Labs</td>
			<td style="width:105px;">664270</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Sterile Deionized Water &#8211; 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">1st Base Laboratory</td>
			<td style="width:105px;">CUS-4100-100ml</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1</td>
			<td style="width:148px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Surgical Sterile Bag</td>
			<td style="width:148px;">SPS Laboratoires</td>
			<td style="width:105px;">98ULT01240</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Syringe BD Discardit II 20 mL sterile</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">300296</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Syringe Filter 0.22 &#181;m 33 mm sterile</td>
			<td style="width:148px;">ClearLine</td>
			<td style="width:105px;">51732</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Zen lite 2.3 Lite Software</td>
			<td style="width:148px;">Zeiss</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:375px;">Microscope associated software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automatic pd-l1 characterization and enumeration of circulating tumor cells from non-small cell lung cancer patients by immunofluorescence

प्राथमिक ट्यूमर से व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) परिसंचरण खून या लसीका प्रणाली में बहा रहे हैं। इन दुर्लभ कोशिकाओं (1 "10 कोशिकाओं रक्त के प्रति एमएल) एक गरीब रोग का रोग का पूर्वानुमान वारंट और कई कैंसर में कम समग्र अस्तित्व के साथ सहसंबद्ध हैं (उदा., स्तन, प्रोस्टेट और कोलोरेक्टल). वर्तमान में, विरोधी EpCAM लेपित चुंबकीय मनका आधारित सीटीसी कब्जा प्रणाली खून में सीटीसी की गणना के लिए अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित सोने के मानक परीक्षण है. यह परीक्षण एंटी-एपकैम मार्कर के साथ लेपित चुंबकीय मोती के उपयोग पर आधारित है, जो विशेष रूप से उपकला कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करते हैं। कई अध्ययनों से स्पष्ट है कि EpCAM CTC का पता लगाने के लिए इष्टतम मार्कर नहीं है। दरअसल, सीटीसी कैंसर कोशिकाओं की एक विषम उपजनसंख्या हैं और मेटास्टैटिक प्रसार और आक्रमण के साथ जुड़े एक उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरने में सक्षम हैं। इन CTCs सेल सतह उपकला मार्कर EpCAM की अभिव्यक्ति को कम करने में सक्षम हैं, जबकि इस तरह के vimentin के रूप में mesenchymal मार्करों में वृद्धि. इस तकनीकी बाधा को दूर करने के लिए, सीटीसी के भौतिक गुणों पर आधारित अन्य अलगाव विधियां विकसित की गई हैं। Microfluidic प्रौद्योगिकियों पूरे रक्त के नमूनों से सीटीसी संवर्धन के लिए एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण सक्षम. सर्पिल microfluidic प्रौद्योगिकी एक सर्पिल microfluidic चिप के भीतर उत्पन्न घुमावदार चैनलों में निरंतर प्रवाह के साथ जड़त्वीय और डीन खींचें बलों का उपयोग करता है. कोशिकाओं को सामान्य रक्त कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच आकार और प्लास्टिक में अंतर के आधार पर अलग कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल का विवरण CTCs के क्रमादेशित मौत-लिगंड 1 (पीडी-L1) अभिव्यक्ति की विशेषता के लिए विभिन्न चरणों, अनुकूलन इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) मार्कर सेट के साथ एक सर्पिल microfluidic डिवाइस के संयोजन.

पहली पूर्व आवश्यकता ऊतक संस्कृति के लिए CTCs के uncontaminated (संक्रामक एजेंट मुक्त) संग्रह प्राप्त करने और यदि पृष्ठभूमि उत्पन्न से बचने के लिए किया गया था। विसंदूषण प्रोटोकॉल सभी पाइपों और पंपों की सफाई सक्षम ?...

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Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) घूम की विशेषता अनुवाद अनुसंधान में एक लोकप्रिय विषय है. इस प्रोटोकॉल पीडी-L1 विशेषता और गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) रोगी के नमूने में सीटीसी की गणना के लिए एक अर्द्ध स्वचालित इम्यूनोफ्लोरेसी (आईएफ) परख का वर्णन करता है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर रोगियों से अर्द्ध-स्वचालित पीडी-एल 1 विशेषता और परिसंचरण ट्यूमर कोशिकाओं की गणना

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के आधार पर, सामान्य रक्त कोशिका से सीटीसी के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए विशिष्ट सीटीसी बायोमार्कर के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है, और यह सेल संस्कृति के साथ संगत है। यह प्रोटोकॉल सीटीसी निष्कर्षण की उच्च दर की सुविधा प्रदान करता है, और घातक साइटोमोर्फोर्फोलॉजिकल विशेषताओं का मूल्यांकन करके सीटीसी का एक व्यापक साइटोलॉजिकल विश्लेषण प्रदान करता है। सीटीसी द्वारा पीडी-एल1 अभिव्यक्ति फेफड़ों के कैंसर प्रबंधन में एक भविष्य कहनेवाला मूल्य है।इस परीक्षण का उपयोग कर इसका पता लगाने में सुधार लंबी अवधि में एक बेहतर रोगी प्रबंधन को बढ़ावा दे सकता है । इस प्रोटोकॉल के अन्य अनुप्रयोगों में मछली का उपयोग करके आनुवंशिक विपथनों का पता लगाना, या सीटीसी पर ट्रांसक्रिप्टोर्मिक विश्लेषण करना, साथ ही माताओं में भ्रूण मूल की कोशिकाओं को अलग करना शामिल है। प्रक्रिया का प्रदर्शन जूली Balandier, हमारी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा ।पूर्व विश्लेषणात्मक परिसंचारी ट्यूमर सेल संवर्धन के लिए, पहले एक पोटेशियम EDTA ट्यूब में रक्त के ७.५ मिलीलीटर इकट्ठा, और कोमल आंदोलन के तहत नमूना रखने के लिए सेल तलछट और थक्के से बचने के लिए । संग्रह के छह घंटे के भीतर, एक माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें, एक नए ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पूरे रक्त के ७.५ मिलीलीटर तक स्थानांतरित करने के लिए, और १६०० बार जी पर 10 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र, कमरे के तापमान पर । अपकेंद्रित्र के अंत में, बफी कोट को परेशान किए बिना प्लाज्मा अंश एकत्र करने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें, और 7.5 मिलीलीटर तक पीबीएस के समकक्ष मात्रा के साथ प्लाज्मा को पतला करें।इसके बाद, ध्यान से रक्त के नमूने में लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर जोड़ें, 30 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब रखने से पहले, रक्त संग्रह ट्यूब को तीन बार धीरे से उलटा करें। इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और ध्यान से सभी लेकिन सुपरनेट के अंतिम चार से पांच मिलीलीटर को हटा दें। शेष सुपरनेट को हटाने के लिए फ़िल्टर किए गए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, और ट्यूब की दीवार के नीचे पुन: निलंबन बफर के एक मिलीलीटर को जोड़ने के लिए फ़िल्टर किए गए टिप के साथ P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए, सेल पेलेट को कोमल पिपटिंग के साथ फिर से खर्च करें, जब तक कि नमूना समरूप न हो। जब गोली को फिर से निलंबित कर दिया गया है, तो बुलबुले को पेश किए बिना ट्यूब की दीवार में एक अतिरिक्त तीन मिलीलीटर पुनः पेंशन बफर जोड़ें, और धीरे-धीरे कोशिकाओं को फिर से मिलाएं। सर्पिल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के लिए ट्यूमर सेल संवर्धन परिसंचारी, पहले डिवाइस पर एक नया सर्पिल माइक्रोफ्लुइडिक चिप लोड करें, और प्रत्येक इनपुट और आउटपुट पोर्ट में एक खाली 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब लोड करें।तीन मिनट के लिए सर्पिल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को प्राइम करने के लिए प्राइम पर क्लिक करें । चक्र के अंत में इनपुट और आउटपुट ट्यूब को हटाना। इनपुट पोर्ट में पुनर्निर्धारित रक्त नमूना लोड करें, और आउटपुट पोर्ट में एक स्पष्ट 15 मिलीलीटर शंकुदाता लोड करें।फिर चलाने पर क्लिक करें, और 31 मिनट परिसंचारी ट्यूमर सेल संवर्धन कार्यक्रम शुरू करने के लिए तीन कार्यक्रम का चयन करें। चक्र के अंत में आउटपुट ट्यूब को अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें, और सुपरनैंट के अंतिम दो मिलीलीटर को हटाने के लिए पांच मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। फिर सुपरनेट के सभी लेकिन अंतिम 100 माइक्रोलीटर को हटाने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए, कोशिकाओं को एक हीमोसाइटोमीटर में गिनें, और समृद्ध नमूने को 0.2% एंटी-बाइंडिंग समाधान एकाग्रता के प्रति 100 माइक्रोलीटर प्रति दस से पांचवीं कोशिकाओं में एक गुना दस से पांचवें कोशिकाओं को पतला करें। इसके बाद, नमूना कक्ष के समोच्च को गीला करने के लिए एंटी-बाइंडिंग समाधान के 50 माइक्रोलीटर से लथपथ एक कपास झाड़ू का उपयोग करें, और नमूना कक्ष में पॉलीसाइन ग्लास स्लाइड रखें। कक्ष को बंद करें, और सुपरनैंट के अंतिम 100 माइक्रोलीटर में नमूने को फिर से खर्च करने से पहले बाध्यकारी समाधान के साथ माइक्रोपिपेट टिप को कोट करने के लिए तीन बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।सेल समाधान को नमूना कक्ष में स्थानांतरित करें और कम त्वरण पर चार मिनट के लिए प्रति मिनट 400 घूर्णन पर एक समर्पित अपकेंद्रित्र में नमूना साइटोस्पिन करें। अपकेंद्रित्र के अंत में, बयान के क्षेत्र के चारों ओर एक सिलिकॉन आइसोलेटर रखें और स्लाइड को दो मिनट के लिए माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट के तहत सूखने दें, फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 माइक्रोलीटर के साथ साइटोस्पन नमूने को ठीक करें, इसके बाद कमरे के तापमान पर पीबीएस प्रति वॉश के 200 माइक्रोलिटर्स के साथ तीन दो मिनट की वॉश करें। अंतिम धोने के बाद, कमरे के तापमान पर रिएजेंट को अवरुद्ध करने में 30 मिनट इनक्यूबेशन के साथ किसी भी गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करें, इसके बाद ब्याज के एंटीबॉडी समाधान के 100 माइक्रोलीटर के साथ लेबलिंग करें।एक १०० द्वारा 15 मिलीलीटर पेट्री डिश में लेबल स्लाइड बाँझ पानी के दो मिलीलीटर के साथ गीला, और पकवान बंद जगह, चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर, प्रकाश से संरक्षित रखें । अगली सुबह, प्रदर्शन के रूप में PBS के साथ तीन बार नमूना धोने, और एक उपयुक्त बढ़ते समाधान और एक गिलास कवर पर्ची के 10 माइक्रोलीटर के साथ नमूना माउंट । इसके बाद साफ नेल पॉलिश से कवर स्लिप को सील करें।साइटोस्पन नमूनों की छवि के लिए, एक एक्स वाई मोटराइज्ड प्लेटफॉर्म के साथ सीधे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर स्लाइड लोड करें, और एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस के अनुसार 20x उद्देश्य और उपयुक्त चैनलों का चयन करें। पारा दीपक चालू करें और माइक्रोस्कोप और संबद्ध सॉफ्टवेयर को अर्ध-स्वचालित शूट में अनुकूलित करें। जब दीपक तैयार हो जाता है, तो अधिग्रहण मेनू में, चार चैनलों को परिभाषित करें, एक्सपोजर समय निर्धारित करें, और टाइल्स को स्कैन करने के लिए परिभाषित करें।टाइल्स पर क्लिक करें, और उन्नत प्रयोग, और स्कैन करने के लिए क्षेत्र को परिभाषित करें। फिर स्क्रीन पर फोकस समायोजित करें, और शुरू प्रयोग पर क्लिक करें। प्रयोग के अंत में, प्रत्येक चैनल के लिए टीआईएफ फ़ाइलों का निर्यात करें, और विशेष रूप से नमूना, समय की संख्या, डाई और उप-टाइल्स की संख्या शामिल करने के लिए फ़ाइल का नाम दें।छवि विश्लेषण के लिए, ब्रॉड इंस्टीट्यूट वेबसाइट से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें, और फ़ाइल पर क्लिक करें, फ़ाइल से पाइपलाइन, और चार चैनलों सीटीसी का विश्लेषण करें। फ़ाइलों को फ़ाइल सूची में छोड़ दें, और फाइलों को टाइल्स द्वारा समूहित करने के लिए मेटाडेटा को अपडेट करें। फिर उपाय तीव्रता मापदंडों के अनुरूप स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलने के लिए छवियों का विश्लेषण करने पर क्लिक करें।अनुकूलित विसंदूषण प्रोटोकॉल के बिना, केवल 24 घंटे के बाद समृद्ध A549 सेल लाइनों की ऊतक संस्कृतियों में उच्च जीवाणु संदूषण मनाया जाता है, जिससे यूकेरियोटिक कोशिकाओं में मृत्यु और साइटोमोर्फोलॉजिकल परिवर्तन होते हैं। इसके विपरीत, सफाई प्रोटोकॉल के बाद, जीवित A549 कोशिकाओं को ऊतक संस्कृति और मध्यम हटाने के 10 घंटे के बाद 2 डी संस्कृतियों में प्राप्त किया जाता है, 3 डी संस्कृति की स्थिति के तहत, और रोगी के नमूनों के भीतर। साइटोस्पिन के साथ पॉलीसाइन कोटेड स्लाइड पर तरल इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला परख या इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला परख का उपयोग करना, दो परख के बीच गणना की गई नाभिक की संख्या में एक स्पष्ट अंतर देखा जा सकता है।साइटोस्पिन स्टेप के बिना, गैर-साइटोस्पिन सेल प्रेप में धुंधली रूपरेखा के कारण, ट्यूमर कोशिकाओं से सफेद रक्त कोशिकाओं को अलग करना मुश्किल है। यहां विभिन्न रोगी नमूनों से विभिन्न प्रतिनिधि निष्कर्षों को देखा जा सकता है, विशेष रूप से सफेद रक्त कोशिकाओं की अवशिष्ट गिनती के साथ दृढ़ता से चर होना निर्धारित है, और पूरे रक्त नमूने पर निर्भर है। परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं उप-आबादी में एक उच्च परिवर्तनशीलता भी देखी गई।साइटोस्पिन पर प्रत्येक कोशिका की पहचान छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा की जाती है, और आवश्यक परिणामों की पुष्टि करने के लिए सेल और मैन्युअल रूप से ट्रैकिंग को सक्षम बनाती है। दरअसल, एक पायलट विश्लेषण मैनुअल गणना और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर गणना के बीच एक सामंजस्य का प्रदर्शन किया । प्रोटीन-एंटीबॉडी संकरण के लिए इन-हाउस डिज़ाइन किए गए नम पेट्री डिश का सेटअप महत्वपूर्ण है, क्योंकि डिवाइस पूरे इनक्यूबेशन समय में पर्याप्त रूप से नम रहता है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

फेफड़ों के ट्यूमर सेल भर्ती परख

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

पर कब्जा है और रक्त से व्यवहार्य परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं की रिलीज

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

कोलोरेक्टल कैंसर के ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल में ट्यूमर कोशिकाओं को प्रसारित करने का अलगाव

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

लक्ष्य सेल पूर्व संवर्धन और पूरे जीनोम प्रवर्धन एकल कोशिका बहाव लक्षण वर्णन के लिए

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

फेफड़ों के ऊतकों में ट्यूमर कोशिका दृश्य परिसंचारी के लिए एक फेफड़े औपनिवेशीकरण परख की स्थापना

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

ट्यूमर कोशिकाओं परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए एक चिकित्सा तार का उपयोग कर के लक्षण वर्णन: एक 3 डी दृष्टिकोण इम्यूनोफ्लोरेसेंस और डीएनए मछली पर आधारित

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

अलगाव और सरकोमा रोगी व्युत्पन्न Xenografts से ट्यूमर शुरू कोशिकाओं की विशेषता

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

22C3 विरोधी पीडी-L1 एंटीबॉडी का उपयोग गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के रोगियों से बायोप्सी और Cytology नमूनों पर ध्यान केंद्रित

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

पीडी-L1 एक्सप्रेशन का अध्ययन करने के लिए Syngeneic लंग ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं का Orthotopic ट्रांसप्लांटेशन

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

अनुप्रवाह आण्विक विश्लेषण और मेटास्टेटिक संभावित मूल्यांकन के लिए परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के micromanipulation

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...