Name: semi-automatic pd-l1 characterization and enumeration of circulating tumor cells from non-small cell lung cancer patients by immunofluorescence
Uploaded: 2019-08-14T14:30:00
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この研究は、アストラゼネカ(ロンドン、イギリス)、バイオリディックス(シンガポール)、リーグ・コントル・ル・ガン(フランス・ローレ)からの研究助成金によって支えられた。著者らは、アストラゼネカとバイオリディクスの企業の財政的支援に感謝している。

サンプルは、患者の書面による同意に従ってリヨン大学病院に拠点を置くCIRCAN(「CIRculating CANcer」)コホートの枠組みの中で前向きに収集されました。この研究はCIRCAN_ALLコホートに統合された。CIRCAN_ALLの研究は、参考文献L15-188の下で2015年04月11日付けのCPP南東IVによって非介入として認識された。改訂版は、参考L16-160の下で20/09/2016に非介入として認識されました。CIRCAN_ALL研究は、参照15-131の?...

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	<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+in+Metastatic+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).</li><li>Paz-Ares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+for+Squamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).</li><li>Langer, C. 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本研究では、臨床応用への移植ワークフローの性能に関する2つの大きなポイント、第1の点は、得られた蛍光画像の分析のための主観性の低下に関する2つである。
CTC列挙のための実行可能で最適化されたワークフローは、CTCラベルフリーマイクロ流体システム(スパイラルマイクロ流体デバイス)を介した細胞濃縮後のカスタマイズ可能なIFアッセイを用いて最初に決定さ?...

腫瘍抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、がん「免疫監視」と呼ばれるプロセスを通じて癌への応答に重要な役割を果たします。それらの抗腫瘍機能は、CTLA-4阻害剤およびPD-1/PD-L1阻害剤などの免疫チェックポイント遮断抗体によって増強される。非小細胞肺癌(NSCLC)では、抗PD-1/PD-L1療法は、PD-L1陰性腫瘍患者では0%~17%、PD-L1を発現する患者では36%~100%の応答率をもたらす。黒色腫およびNSCLCで観察されたPD-1/PD-L1遮断に対する強い応答は、全体的な応答率(RR)、耐久性のある臨床上の利点、および無増悪生存(PFS)の改善の証拠によって示される。現在、抗PD1治療は、PD-L1発現にかかわらずニボルマブを有する第2ラインNSCLC治療における治療の標準であり、PD-L1≥1%を発現する患者におけるペンブロリズマブを有する。第一線治療において、治療の標準は、PD-L1≥50%を発現するNSCLC患者において単独でペンブロリズマブであり、化学療法(組織学的サブタイプに応じてプラチンおよび二重薬物)1、2で潜在的に増強することができる。
しかしながら、このような患者管理へのアプローチは議論の余地がある3は、免疫組織化学(IHC)による腫瘍細胞におけるPD-L1発現は、おそらく最も理想的なコンパニオンバイオマーカーではない。腫瘍突然変異負担4(TMB)、マイクロサテライト不安定性(MSI)、および/または微生物叢などの他のものは、単独または組み合わせのいずれかでこの設定において興味深い可能性があります。NSCLCは、空間的に(腫瘍部位から別の腫瘍部位へ)または一時的に(診断から再発まで)異種腫瘍であることが知られている。NSCLCの患者は通常壊れやすく、反復的な侵襲的組織生検が問題になる可能性があります。実際、最初の進行時の再生検率は、系列に応じて46%から84%の範囲であり、成功した再生検(組織学的および完全な分子分析を伴う意味)は33%から75%の範囲である。これは、患者の25%-67%が最初の進行5、6、7、8の間に包括的な再生検分析を受けることができないことを意味する。
「液体生検」の出現は、循環由来の循環性DNA(cfDNA)を調べることにより、疾患進行時の分子変化の重要な再評価を可能にするため、この特定の設定でかなりの熱意を生み出しました。腫瘍細胞(CTC)。これらの生細胞は腫瘍から血流に放出され、そこで自由に循環する。CTCの分析は日常的に使用されていないが、肺癌における分子的および表現型的特徴付け、予後、および予測的意義の場合(DNAseq、RNAseq、miRNAおよびタンパク質分析を介して)において非常に有望であると思われる。実際、CTCは初期マーカーではなく、活性疾患の型表示特性を持つ可能性が高い(診断時に組織生検で検出される)。さらに、CTCは腫瘍組織の空間的不均一性の問題をバイパスし、これは小さな生検において重要な問題でありうる。その結果、CTC上のPD-L1発現は、腫瘍組織を用いた予測バイオマーカーとしての使用に由来する不一致を明らかにする可能性がある。
近年、PD-L1発現はNSCLCのCTCで試験されている。9を検査した患者のほとんどはPD-L1陽性であり、結果とその臨床使用の解釈を複雑にした。全体として、PD-L1陽性CTCは、平均4.5セル/mL10からのサンプルの69.4%で検出された。放射線治療の開始後、PD-L1陽性CTCの割合が有意に増加し、放射線11に応答するPD-L1発現のアップレギュレーションを示した。したがって、PD-L1 CTC分析は、化学療法、放射線、および可能性の高い免疫療法(IT)治療に対する応答を反映する腫瘍および免疫応答の動的変化を監視するために使用することができる。
現在までに、CTCの分離およびPD-L1特性化は、抗EpCAMコーティング磁気ビーズベースのCTC捕捉、濃縮フリーベースのアッセイ、サイズベースの12、13 CTCキャプチャアッセイなどの様々な方法に依存しています。しかし、CTCは転移性NSCLC患者の45%~65%でのみ検出され、転移性NSCLC患者の半数以上に情報を提供する能力が制限されました。さらに、CTC数は、サイズベースのアプローチ10を使用して、これらの研究のほとんどで低かった。さらに、この方法は、健康なドナーの血流における「悪性腫瘍の細胞形態パターン」を有するCD45(-)/DAPI(+)細胞の検出などの不一致をもたらした。これらの懸念は、NSCLCにおける追加の癌バイオマーカー(すなわち、TTF1、ビメンチン、EpCAM、およびCD44)を用いて健康な全血からの非定型CD45(-)細胞の免疫表現型に関連するCTCコレクションの高感度な方法の必要性を強調している。
その結果、慣性とディーンドラッグ力を用いて、マイクロ流体チップを介してサイズと可塑性に基づいて細胞を分離するスパイラルマイクロ流体デバイスを評価しました。マイクロ流体チップに存在するディーン渦の形成は、内壁に沿って位置するより大きなCTCと、チップの外壁に沿ってより小さな免疫細胞をもたらす。濃縮プロセスは、濃縮CTC分画として、より大きな細胞を集出口にサイフォンすることによって完了する。この方法は、特に感受性および特異的(全血の約1 CTC/mLの検出)14であり、カスタマイズされた免疫蛍光(IF)分析に関連させることができる。これらの用具は臨床解釈のための肯定的なしきい値の設定を可能にする。このように、生物学者が高い回復率と特異性を持つ免疫表現型CTCを分離し、免疫性を高めるワークフローを説明します。このプロトコルは、CTCを収集するためのスパイラルマイクロ流体デバイスの最適な使用、癌の種類に応じてカスタマイズできる最適化されたIFアッセイ、および半自動を実行するために細胞画像を測定および分析するための無料のオープンソースソフトウェアの使用について説明します。蛍光染色による細胞の数値化。さらに、顕微鏡多重化は、利用可能な蛍光フィルター/マーカーの数に応じて行うことができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1004px;" width="1004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:148px;">Ozyme</td>
			<td style="width:105px;">BLE 422801</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">BD Facs Clean &#8211; 5L</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">340345</td>
			<td style="width:375px;">Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016012</td>
			<td style="width:375px;">Bleach. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">A8412</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:105px;">BLE304020</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">CellProfiler Software</td>
			<td style="width:148px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:375px;">Image Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge device</td>
			<td style="width:148px;">Hettich</td>
			<td style="width:105px;">4706</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:105px;">430-829</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge Tube 15 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F001004-25</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">ClearCell FX-1 System</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F011002</td>
			<td style="width:375px;">Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">Coulter Clenz Cleaning Agent &#8211; 5L</td>
			<td style="width:148px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:105px;">8448222</td>
			<td style="width:375px;">All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">CTChip FR1S</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-FR001002</td>
			<td style="width:375px;">Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Cytospin 4</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78300003</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Diluent Additive Reagent &#8211; 20 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016009</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">EZ Cytofunnels</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78710003</td>
			<td style="width:375px;">Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">FcR blocking Agent</td>
			<td style="width:148px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:105px;">130-059-901</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:148px;">Gibco</td>
			<td style="width:105px;">10270-106</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">F4680</td>
			<td style="width:375px;">Mounting solution. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fungizone - 50 mg</td>
			<td style="width:148px;">Bristol-Myers-Squibb</td>
			<td style="width:105px;">90129TB29</td>
			<td style="width:375px;">Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">FX1 Input Straw with lock cap</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F013005</td>
			<td style="width:375px;">Straw. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">KovaSlide</td>
			<td style="width:148px;">Dutscher</td>
			<td style="width:105px;">50126</td>
			<td style="width:375px;">Chambered slide. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">53-9003-80</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">11490570</td>
			<td style="width:375px;">Fixation solution. Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:105px;">BLE329706</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:148px;">Dutscher</td>
			<td style="width:105px;">632180</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:148px;">Ozyme</td>
			<td style="width:105px;">BE17-512F</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X &#8211; 1L</td>
			<td style="width:148px;">1st Base Laboratory</td>
			<td style="width:105px;">BUF-2040-1X1L</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Pluronic F-68 10%</td>
			<td style="width:148px;">Gibco</td>
			<td style="width:105px;">24040-032</td>
			<td style="width:375px;">Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Polylysine slides</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Polypropylene Conical Tube 50 mL</td>
			<td style="width:148px;">Falcon</td>
			<td style="width:105px;">352098</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">RBC Lysis Buffer &#8211; 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">G Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">786-649</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">RBC Lysis Buffer &#8211; 250 mL</td>
			<td style="width:148px;">G Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">786-650</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Resuspension Buffer (RSB)</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016003</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Shandon Cytopsin4 centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78300003</td>
			<td style="width:375px;">Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Silicon Isolator</td>
			<td style="width:148px;">Grace bio-Labs</td>
			<td style="width:105px;">664270</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Sterile Deionized Water &#8211; 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">1st Base Laboratory</td>
			<td style="width:105px;">CUS-4100-100ml</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1</td>
			<td style="width:148px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Surgical Sterile Bag</td>
			<td style="width:148px;">SPS Laboratoires</td>
			<td style="width:105px;">98ULT01240</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Syringe BD Discardit II 20 mL sterile</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">300296</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Syringe Filter 0.22 &#181;m 33 mm sterile</td>
			<td style="width:148px;">ClearLine</td>
			<td style="width:105px;">51732</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Zen lite 2.3 Lite Software</td>
			<td style="width:148px;">Zeiss</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:375px;">Microscope associated software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automatic pd-l1 characterization and enumeration of circulating tumor cells from non-small cell lung cancer patients by immunofluorescence

原発性腫瘍に由来する循環腫瘍細胞(CTC)は、血流またはリンパ系に流れ込む。これらの希少細胞(血液のmL当たり1−10細胞)は予後不良を保証し、いくつかの癌(例えば、乳房、前立腺および結腸直腸)の全体的な生存率の短さと相関する。現在、抗EpCAMコーティング磁気ビーズベースのCTC捕捉システムは、血流中のCTCを列挙するための米国食品医薬品局(FDA)によって承認されたゴールドスタンダードテストです。この試験は、特に上皮癌細胞を標的とする抗EpCAMマーカーでコーティングされた磁気ビーズの使用に基づいています。多くの研究は、EpCAMがCTC検出に最適なマーカーではないことを示しています。実際、CTCは癌細胞の不均一な亜集団であり、転移増殖および侵入に関連する上皮間葉転移(EMT)を受けることができる。これらのCTCは、細胞表面上皮マーカーEpCAMの発現を減少させ、ビメンチンなどの間葉系マーカーを増加させることができる。この技術的なハードルに対処するため、CTCの物理的特性に基づく他の分離方法が開発されている。マイクロ流体技術は、全血サンプルからのCTC濃縮に対するラベルフリーのアプローチを可能にします。スパイラルマイクロ流体技術は、スパイラルマイクロ流体チップ内で生成された曲面チャネル内の連続的な流れを持つ慣性およびディーンドラッグ力を使用します。細胞は、正常な血液細胞と腫瘍細胞の間の大きさと可塑性の違いに基づいて分離されます。このプロトコルは、プログラムされた死リガンド1(PD-L1)CTC発現を特徴付けるさまざまなステップを詳細に説明し、スパイラルマイクロ流体デバイスとカスタマイズ可能な免疫蛍光(IF)マーカーセットを組み合わせる。

最初の前提条件は、組織培養のための汚染されていない(感染性薬剤を含まない)CTCのコレクションを取得し、IFの背景が生成されないようにすることです。除染プロトコルは、すべてのパイプとポンプの洗浄を可能にし、細菌汚染なしで良好な回収率でCTCの収集をもたらした。濃縮されたサンプルは、スパイラルマイクロ流体装置の除染プロトコルワークフローの有無と比較した。除染プロト...

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Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

循環腫瘍細胞(CTC)の特徴付けは、翻訳研究で一般的な話題です。このプロトコルは、非小細胞肺癌(NSCLC)患者サンプルにおけるCTCのPD-L1特性測定および列挙に関する半自動免疫蛍光(IF)アッセイについて説明する。

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

マイクロ流体技術に基づいて、正常な血液細胞からのCTCの単離および特性評価は、特定のCTCバイオマーカーの使用を必要とせず、細胞培養と互換性があります。このプロトコルは、CTC抽出の高い率を容易にし、悪性細胞形態学的特性を評価することによって、CTCの広範な細胞学的分析を提供する。CTCによるPD-L1発現は、肺癌管理において予測値を有する。このテストを用いた検出の改善は、長期的により良い患者管理を促進することができる。このプロトコルの他のアプリケーションには、FISHを使用して遺伝的収差を検出すること、またはCTC上でトランスクリプト分析を行うだけでなく、母親の胎児起源の細胞を単離することが含まれます。手順を実証することは、私たちの研究室の技術者ジュリー・バランディエです。前分析循環腫瘍細胞の濃縮のために、最初に7.5ミリリットルの血液をEDTAカリウムチューブに集め、細胞沈殿や凝固を避けるためにサンプルを穏やかな攪拌下に保ちます。採取から6時間以内に、微生物安全キャビネットの下で血清学的ピペットを使用して、最大7.5ミリリットルの全血を新しい50ミリリットル遠心管に移し、室温で1600倍Gで10分間遠心分離します。遠心分離の終わりに、伝達ピペットを使用して、バフィーコートを乱すことなくプラズマ画分を収集し、同等のPBSの体積でプラズマを7.5ミリリットルまで希釈します。次に、血液サンプルに赤血球のリシスバッファーを慎重に加え、最終体積の30ミリリットルにし、採取管を3回軽く反転してから、チューブを室温で10分間置く。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞を収集し、慎重に上清の最後の4〜5ミリリットルを除くすべてを除去します。フィルター処理されたマイクロピペットを使用して残りの上清を除去し、フィルターチップ付きのP1000マイクロピペットを使用して、チューブの壁に1ミリリットルの再懸濁液バッファーを追加します。気泡を導入しないように、サンプルが均質になるまで、穏やかなピペットで細胞ペレットを再懸濁します。ペレットが再懸濁されたら、気泡を導入することなく、チューブの壁に3ミリリットルの再懸濁液を加え、細胞を再び穏やかに混合します。スパイラルマイクロ流体デバイス循環腫瘍細胞濃縮のために、まず新しいスパイラルマイクロ流体チップをデバイスにロードし、空の50ミリリットル遠心管を各入力および出力ポートにロードします。素数をクリックして、スパイラルマイクロ流体デバイスを3分間プライムします。サイクルの最後に入力および出力チューブを取り外す。再中断した血液サンプルを入力ポートにロードし、明確な15ミリリットルの円錐チューブを出力ポートにロードします。次に実行をクリックし、プログラム3を選択して31分間の循環腫瘍細胞濃縮プログラムを開始します。サイクルの終わりには、遠心分離機に出力チューブを転送し、上清の最後の2ミリリットルを除くすべてを除去するために5ミリリットル血清ピペットを使用します。その後、上清の最後の100マイクロリットルを除くすべてを除去するためにマイクロピペットを使用してください。免疫蛍光染色の場合、血球計で細胞を数え、濃縮したサンプルを0.2%抗結合溶液濃度の100マイクロリットル当たり10倍から5番目の細胞に希釈します。次に、50マイクロリットルの抗結合溶液を浸した綿棒を使用して、サンプルチャンバーの輪郭を湿らせ、サンプルチャンバにポリリジンガラススライドを置く。チャンバーを閉じ、ピペットを3回上下して、上清の最後の100マイクロリットルでサンプルを再懸濁する前に、結合溶液でマイクロピペットチップをコーティングする。細胞溶液をサンプルチャンバーに移し、サンプルを4分あたり400回転で、低加速度で専用遠心分離機で細胞回転します。遠心分離の終わりに、堆積物の領域の周りにシリコーンアイソレーターを置き、微生物学的安全キャビネットの下でスライドを2分間乾燥させ、その後、サイトスパンサンプルを室温で10分間4%パラホルムアルデヒドの100マイクロリットルで固定し、続いて1回200マイクロリットルのPBSを室温で洗浄して3分間洗浄します。最後の洗浄後、室温でのブロッキング試薬で30分間インキュベーションを行い、その後、目的の抗体溶液を100マイクロリットルで標識して非特異的結合をブロックする。ラベル付きスライドを100%15ミリリットルのシャーレに2ミリリットルの無菌水で湿らせた吸収性紙の上に置き、皿を一晩摂氏4度で閉じ、光から保護します。翌朝、サンプルをPBSで3回洗浄し、適切な取り付け溶液とガラスカバースリップを10マイクロリットルで取り付けます。その後、カバースリップを透明なマニキュアで密封します。細胞球菌サンプルを画像化するには、X Y電動プラットフォームを備えたストレート蛍光顕微鏡にスライドをロードし、抗体標識に使用するフルオロフォアに従って20倍の目的と適切なチャネルを選択します。水銀ランプをオンにし、顕微鏡と関連ソフトウェアを半自動撮影に適応させます。ランプの準備ができたら、取得メニューで 4 つのチャンネルを定義し、露出時間を設定し、スキャンするタイルを定義します。タイルをクリックし、高度な実験を行い、スキャンする領域を定義します。次に、画面上のフォーカスを調整し、[実験の開始] をクリックします。実験の最後に、各チャネルの TIF ファイルをエクスポートし、サンプル、回数、仕分け、サブタイルの数を含むファイルに具体的に名前を付けます。画像解析では、ブロードインスティチュートの Web サイトから画像解析ソフトウェアを開き、[ファイル]、[ファイルからのパイプライン]、[分析 4 つのチャネルの CTC] をクリックします。ファイルをファイル リストにドロップし、メタデータを更新して、タイルでファイルをグループ化します。次に、[画像を解析]をクリックして、計測強度パラメータに対応するスプレッドシートファイルを開きます。最適化された除染プロトコルがなければ、わずか24時間後に濃縮されたA549細胞株の組織培養において高い細菌汚染が観察され、真核細胞の死および細胞形態変化を引き起こす。これに対して、洗浄プロトコルの後、生きたA549細胞は、10時間の組織培養および培地除去後の2D培養において、3D培養条件下、および患者試料内で得られる。細胞スピンを用いたポリリジン被覆スライド上の液体免疫蛍光染色アッセイまたは免疫蛍光染色アッセイを用いて、2つのアッセイ間に列挙される核の数の明確な区別が観察できる。細胞スピンステップがなければ、非細胞スピン細胞の準備におけるぼやけた輪郭のために、白血球を腫瘍細胞から分化することは困難である。ここで異なる患者試料からの異なる代表的な所見が観察され、特に白血球の残存数が強く可変であると判断され、全血サンプルに依存する。また、得られた循環腫瘍細胞のサブ集団においても高い変動性が認められた。細胞スピン上の各細胞は画像解析ソフトウェアによって識別され、細胞の追跡を可能にし、必要に応じて結果を手動で確認する。実際、パイロット分析は、手動列挙と画像解析ソフトウェアの列挙との間の一見を示しました。タンパク質抗体ハイブリダイゼーション用の社内設計の湿ったシャーレのセットアップは、デバイスがインキュベーション時間全体を通して十分に湿ったままであるため、非常に重要です。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

肺腫瘍細胞募集試験

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

循環腫瘍細胞を取り込むため医療用ワイヤー線を用いた腫瘍細胞の特性解析: 蛍光抗体法や DNA 魚に基づく 3 D アプローチ

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

アンチ PD L1 抗体は生検で非小細胞肺癌患者からの細胞のサンプル集中 22 3 を使用して

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...