Name: semi-automatic pd-l1 characterization and enumeration of circulating tumor cells from non-small cell lung cancer patients by immunofluorescence
Uploaded: 2019-08-14T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios de pesquisa da AstraZeneca (Londres, Reino Unido), Biolidicos (Singapura) e da Ligue contre le Cancer (Saone et Loire, França). Os autores agradecem à AstraZeneca e às empresas de Biolidicos pelo seu apoio financeiro.

As amostras foram coletadas prospectivamente no âmbito da coorte CIRCAN ("câncer circulante") com base no hospital universitário de Lyon, após o consentimento por escrito do paciente. Este estudo foi integrado na coorte CIRCAN_ALL. O estudo CIRCAN_ALL foi reconhecido como não intervencionista pelo CPP sudeste IV datado de 04/11/2015 a referência L15-188. Uma versão alterada foi reconhecida como não intervencionista em 20/09/2016 a referência L16-160. O estudo CIRCAN_ALL foi declarado ao IT e ao correspondente da...

<ol>
	<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+in+Metastatic+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).</li><li>Paz-Ares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+for+Squamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).</li><li>Langer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced,+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer:+a+randomised,+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study.">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li><li>Hellmann, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Mutational+Burden+and+Efficacy+of+Nivolumab+Monotherapy+and+in+Combination+with+Ipilimumab+in+Small-Cell+Lung+Cancer.">Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer.</a> Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).</li><li>Chouaid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+and+clinical+impact+of+re-biopsy+in+advanced+non+small-cell+lung+cancer:+a+prospective+multicenter+study+in+a+real-world+setting+(GFPC+study+12-01).">Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01).</a> Lung cancer. 86 (2), 170-173 (2014).</li><li>Nosaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-biopsy+status+among+non-small+cell+lung+cancer+patients+in+Japan:+A+retrospective+study.">Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study.</a> Lung cancer. 101, 1-8 (2016).</li><li>Uozu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+tissue+re-biopsy+in+non-small+cell+lung+cancers+resistant+to+previous+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor+therapies.">Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).</li><li>Kim, T. 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Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).</li><li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+Circulating+Tumor+DNA+(ctDNA)+in+Plasma+of+non-small+cell+lung+cancer+(NSCLC)+patients,+Monitoring+of+EGFR+p.T790M+mutated+allelic+fraction+using+BEAMing+Companion+Assay+and+Evaluation+in+future+application+in+mimicking+Circulating+Tumors+Cells+(mCTC).">Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC).</a> Cancer Medicine. , (2019).</li><li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+pre-analytical+conditions+and+comparison+of+the+performance+of+several+digital+PCR+assays+for+the+detection+of+major+EGFR+mutations+in+circulating+DNA+from+non-small+cell+lung+cancers:+the+CIRCAN_0+study.">Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study.</a> Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).</li><li>Lustberg, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+validation+of+an+ultra+high-throughput+spiral+microfluidics+for+the+detection+and+enrichment+of+viable+circulating+tumor+cells.">Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells.</a> PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).</li><li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma:+Comparison+among+cytology,+small+biopsy,+and+surgical+resection+specimens.">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li><li>Biswas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+performance+of+endobronchial+ultrasound-guided+transbronchial+needle+aspiration+for+assessing+programmed+death+ligand-1+expression+in+nonsmall+cell+lung+cancer.">Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer.</a> Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).</li><li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing:+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li></ol>

Dois pontos principais foram levantados no presente estudo, o primeiro com relação ao desempenho do fluxo de trabalho para sua transferência para aplicações clínicas, e o segundo referente à diminuição da subjetividade para a análise das imagens de fluorescência obtidas.
Um fluxo de trabalho performant e aperfeiçoado para A enumeração CTC foi determinado inicialmente usando o teste customizável do If após o enriquecimento da pilha através de um sistema microfluídicos Label-Fr...

Os linfócitos T citotóxicos antígeno-específicos do tumor (CTLs) jogam um papel crucial na resposta aos cancros através de um processo sabido como o cancer "fiscalização imune". Suas funções antitumorais são reforçadas por anticorpos imunológicos de bloqueio de ponto de verificação, como inibidores da CTLA-4 e inibidores da PD-1/PD-L1. No câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), as terapias anti-PD-1/PD-L1 resultam em taxas de resposta variando de 0%-17% em pacientes com tumores PD-L1-negativos e 36%-100% naqueles que expressam PD-L1. As respostas robustas ao bloqueio PD-1/PD-L1 observadas no melanoma e no NSCLC são mostradas pela evidência da taxa de resposta global melhorada (RR), dos benefícios clínicos duráveis, e da sobrevivência livre de progressão (PFS). Actualmente, os tratamentos PD1 são o padrão de cuidados no tratamento com NSCLC de segunda linha com nivolumab, independentemente da expressão PD-L1 e com pembrolizumab em doentes que expressam PD-L1 ≥ 1%. No tratamento de primeira linha, o padrão de cuidado é pembrolizumab isoladamente em pacientes com NSCLC expressando PD-L1 ≥ 50% e pode ser potencialmente reforçada com quimioterapia (platina e droga de dúvida dependendo do subtipo histológico)1,2.
Entretanto, tal aproximação à gerência paciente é discutível3, desde que a expressão de PD-L1 em pilhas do tumor por immunohistochemistry (IHC) é provavelmente não o Biomarker o mais ideal do companheiro. Outros, como a carga de mutação tumoral4 (TMB), a instabilidade de MICROSSATÉLITES (MSI) e/ou a microbiota são possivelmente interessantes neste ajuste isoladamente ou em combinação. NSCLC é sabido para ser tumores heterogêneos, ou espacialmente (de um local do tumor a um outro) ou temporally (do diagnóstico ao retorno). Os pacientes com NSCLC são geralmente frágeis, e as biópsias invasoras iterativas do tecido podem ser uma edição. Na verdade, a taxa de re-biópsia na primeira progressão varia de 46%-84%, dependendo da série, e a re-biópsia bem-sucedida (significado com análise histológica e completa molecular) varia de 33%-75%. Isso significa que 25%-67% dos pacientes não podem receber uma análise de re-biópsia abrangente durante a primeira progressão5,6,7,8.
O advento das "biópsias líquidas" gerou assim um entusiasmo considerável neste cenário particular, pois possibilita uma reavaliação crucial das alterações moleculares durante a progressão da doença, examinando o DNA livre circulante (cfDNA) derivado da circulação células tumorais (CTCs). Estas células vivem são liberados do tumor para a corrente sanguínea, onde circulam livremente. Embora não seja rotineiramente utilizado, a análise de CTCs parece ser altamente promissora no caso de caracterização molecular e fenotípica, prognóstico e significância preditiva no câncer de pulmão (via Dnaseq, Rnaseq, Mirna e análise proteica). Certamente, os CTCs provavelmente abrigam características fenotípicas da doença ativa um pouco do que os marcadores iniciais (detectados em biópsias do tecido no diagnóstico). Além disso, os CTCs contorneam o problema da heterogeneidade espacial do tecido do tumor, que pode ser uma edição crucial em biópsias pequenas. Consequentemente, a expressão de PD-L1 em CTCs pode potencialmente lançar luz sobre as discrepâncias derivadas de seu uso como um biomarcador preditivo usando tecido tumoral.
Recentemente, a expressão PD-L1 foi testada em CTCs do NSCLC. Quase todos os pacientes testados9 foram positivos para PD-L1, complicando a interpretação do resultado e seu uso clínico. Em geral, os CTCs PD-L1-positivos foram detectados em 69,4% das amostras de uma média de 4,5 células/mL10. Após o início da radioterapia, a proporção de CTCs PD-L1-positivas aumentou significativamente, indicando a upregulação da expressão de PD-L1 em resposta à radiação11. Daqui, a análise do CTCs PD-L1 pode ser usada para monitorar mudanças dinâmicas do tumor e da resposta imune, que podem refletir a resposta à quimioterapia, à radiação, e aos tratamentos prováveis da imunoterapia (TI).
Até o momento, o isolamento CTCs e a caracterização PD-L1 dependem de vários métodos, como captura de CTC com base em talão magnético revestido com anti-epcam, ensaio baseado em enriquecimento e com base em tamanho de12,13 ensaios de captura de CTC. Entretanto, os CTCs foram detectados somente em 45%-65% dos pacientes com NSCLC metastático, limitando assim sua habilidade de fornecer toda a informação para mais do que a metade de pacientes metastáticos de NSCLC. Além, a contagem do CTC era baixa em a maioria destes estudos usando a aproximação tamanho-baseada10. Além disso, este método conduziu às discrepâncias tais como a deteção de pilhas de CD45 (-)/DAPI (+) com "testes padrões citomorfológicos da malignidade" na circulação sanguínea de doadores saudáveis. Estas preocupações destacam a necessidade de um método altamente sensível de coleta de CTC associado à imuno-fenotipagem de células CD45 (-) atípicas de sangue total saudável usando biomarcadores adicionais de câncer (i.e., TTF1, Vimentin, EpCAM e CD44) no NSCLC.
Consequentemente, avaliamos um dispositivo microfluídico espiral que utiliza forças de arrasto inercial e Dean para separar as células com base no tamanho e na plasticidade através de um chip microfluídico. A formação de fluxos de vórtice Dean presente nos resultados de chip microfluídico em CTCs maiores localizados ao longo da parede interna e células imunes menores ao longo da parede externa do chip. O processo de enriquecimento é completado por desviando as células maiores na tomada de coleta como a fração de CTC enriquecida. Este método é particularmente sensível e específico (detecção de cerca de 1 CTC/mL de sangue total)14 e pode ser associado a análises de imunofluorescência (if) personalizadas. Estas ferramentas permitirão a criação de um limiar positivo para a interpretação clínica. Um fluxo de trabalho é descrito assim que permite que os biólogos isolem e immunophenotype CTCs com uma taxa elevada de recuperação e de especificidade. O protocolo descreve o uso ideal do dispositivo microfluídico espiral para coletar CTCs, os ensaios otimizados IF que podem ser personalizados de acordo com o tipo de câncer, e o uso de software livre de código aberto para medir e analisar imagens de células para executar um semiautomático numeração das células de acordo com a coloração fluorescente. Além disso, a multiplexação por microscópio pode ser realizada dependendo do número de filtros/marcadores fluorescentes disponíveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1004px;" width="1004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:148px;">Ozyme</td>
			<td style="width:105px;">BLE 422801</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">BD Facs Clean &#8211; 5L</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">340345</td>
			<td style="width:375px;">Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016012</td>
			<td style="width:375px;">Bleach. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">A8412</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:105px;">BLE304020</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">CellProfiler Software</td>
			<td style="width:148px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:375px;">Image Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge device</td>
			<td style="width:148px;">Hettich</td>
			<td style="width:105px;">4706</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:105px;">430-829</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Centrifuge Tube 15 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F001004-25</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">ClearCell FX-1 System</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F011002</td>
			<td style="width:375px;">Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">Coulter Clenz Cleaning Agent &#8211; 5L</td>
			<td style="width:148px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:105px;">8448222</td>
			<td style="width:375px;">All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">CTChip FR1S</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-FR001002</td>
			<td style="width:375px;">Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Cytospin 4</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78300003</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Diluent Additive Reagent &#8211; 20 mL</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016009</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:376px;">EZ Cytofunnels</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78710003</td>
			<td style="width:375px;">Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">FcR blocking Agent</td>
			<td style="width:148px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:105px;">130-059-901</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:148px;">Gibco</td>
			<td style="width:105px;">10270-106</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">F4680</td>
			<td style="width:375px;">Mounting solution. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Fungizone - 50 mg</td>
			<td style="width:148px;">Bristol-Myers-Squibb</td>
			<td style="width:105px;">90129TB29</td>
			<td style="width:375px;">Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">FX1 Input Straw with lock cap</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F013005</td>
			<td style="width:375px;">Straw. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">KovaSlide</td>
			<td style="width:148px;">Dutscher</td>
			<td style="width:105px;">50126</td>
			<td style="width:375px;">Chambered slide. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">53-9003-80</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">11490570</td>
			<td style="width:375px;">Fixation solution. Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:105px;">BLE329706</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:148px;">Dutscher</td>
			<td style="width:105px;">632180</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:148px;">Ozyme</td>
			<td style="width:105px;">BE17-512F</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X &#8211; 1L</td>
			<td style="width:148px;">1st Base Laboratory</td>
			<td style="width:105px;">BUF-2040-1X1L</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Pluronic F-68 10%</td>
			<td style="width:148px;">Gibco</td>
			<td style="width:105px;">24040-032</td>
			<td style="width:375px;">Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Polylysine slides</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Polypropylene Conical Tube 50 mL</td>
			<td style="width:148px;">Falcon</td>
			<td style="width:105px;">352098</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">RBC Lysis Buffer &#8211; 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">G Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">786-649</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">RBC Lysis Buffer &#8211; 250 mL</td>
			<td style="width:148px;">G Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">786-650</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Resuspension Buffer (RSB)</td>
			<td style="width:148px;">Biolidics</td>
			<td style="width:105px;">CBB-F016003</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: +4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Shandon Cytopsin4 centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:105px;">A78300003</td>
			<td style="width:375px;">Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Silicon Isolator</td>
			<td style="width:148px;">Grace bio-Labs</td>
			<td style="width:105px;">664270</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Sterile Deionized Water &#8211; 100 mL</td>
			<td style="width:148px;">1st Base Laboratory</td>
			<td style="width:105px;">CUS-4100-100ml</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1</td>
			<td style="width:148px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Surgical Sterile Bag</td>
			<td style="width:148px;">SPS Laboratoires</td>
			<td style="width:105px;">98ULT01240</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Syringe BD Discardit II 20 mL sterile</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:105px;">300296</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:376px;">Syringe Filter 0.22 &#181;m 33 mm sterile</td>
			<td style="width:148px;">ClearLine</td>
			<td style="width:105px;">51732</td>
			<td style="width:375px;">Storage conditions: Room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Zen lite 2.3 Lite Software</td>
			<td style="width:148px;">Zeiss</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:375px;">Microscope associated software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automatic pd-l1 characterization and enumeration of circulating tumor cells from non-small cell lung cancer patients by immunofluorescence

As células tumorais circulantes (CTCs) derivadas do tumor primário são derramadas na corrente sanguínea ou no sistema linfático. Estas pilhas raras (1 − 10 pilhas por o mL do sangue) justificam um prognóstico pobre e são correlacionadas com a sobrevivência total mais curta em diversos cancros (por exemplo, peito, próstata e colorectal). Atualmente, o sistema de captura de CTC com base em talão magnético anti-EpCAM é o teste padrão ouro aprovado pela administração de alimentos e drogas dos EUA (FDA) para enumerar CTCs na corrente sanguínea. Este teste é baseado no uso de grânulos magnéticos revestidos com os marcadores anti-EpCAM, que visam especificamente as células cancerosas epiteliais. Muitos estudos têm ilustrado que EpCAM não é o marcador ideal para a detecção de CTC. De fato, os CTCs são uma subpopulação heterogênea de células cancerosas e são capazes de sofrer uma transição epitelial-mesenquimais (EMT) associada à proliferação e invasão metastáticas. Estes CTCs são capazes de reduzir a expressão do marcador epitelial de superfície celular EpCAM, enquanto aumentam os marcadores mesenquimais como vimentina. Para abordar este obstáculo técnico, outros métodos de isolamento baseados em propriedades físicas de CTCs foram desenvolvidos. As tecnologias microfluidic permitem uma aproximação Label-Free ao enriquecimento de CTC das amostras de sangue inteiras. A tecnologia microfluídico espiral usa as forças de arrasto inercial e Dean com fluxo contínuo em canais curvados gerados dentro de um chip microfluídico espiral. As células são separadas com base nas diferenças de tamanho e plasticidade entre as células sanguíneas normais e células tumorais. Este protocolo detalha as etapas diferentes para caracterizar a expressão programada do Death-ligand 1 (PD-L1) dos CTCs, combinando um dispositivo microfluídicos espiral com o conjunto de marcador customizável da imunofluorescência (if).

O primeiro pré-requisito foi a obtenção de coleções não contaminadas (sem agente infeccioso) de CTCs para cultura tecidual e evitar o fundo IF gerado. O protocolo de descontaminação permitiu a limpeza de todos os tubos e bombas, e resultou na coleta de CTCs com uma boa taxa de recuperação sem contaminação bacteriana. As amostras enriquecidas foram comparadas sem e com o fluxo de trabalho do protocolo de descontaminação do dispositivo microfluídico espiral. Para validar o protocolo de descontaminação, uti...

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Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Com base na tecnologia microfluida, o isolamento e a caracterização dos CTCs a partir de células sanguíneas normais não exigem o uso de biomarcadores CTC específicos, e é compatível com a cultura celular. Este protocolo facilita uma alta taxa de extração de CTC, e fornece uma extensa análise citológica dos CTCs, avaliando características citomorfológicas malignas. A expressão PD-L1 por CTCs tem um valor preditivo no gerenciamento do câncer de pulmão.A melhoria de sua detecção usando este teste poderia promover uma melhor gestão do paciente a longo prazo. Outras aplicações deste protocolo incluem a detecção de aberrações genéticas usando FISH, ou a realização de análises transcriômicas em CTCs, bem como a isolação de células de origem fetal em mães. Demonstrando o procedimento estará Julie Balandier, uma técnica do nosso laboratório.Para o enriquecimento pré-analítica das células tumorais circulantes, primeiro colete 7,5 mililitros de sangue em um tubo EDTA de potássio, e mantenha a amostra sob agitação suave para evitar sedimentação celular e coagulação. Dentro de seis horas após a coleta, use uma pipeta sorológica sob um armário de segurança microbiológica, para transferir até 7,5 mililitros de sangue inteiro para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros, e centrifugar a amostra por 10 minutos a 1600 vezes G, à temperatura ambiente. No final da centrifugação, use uma pipeta de transferência para coletar a fração de plasma sem perturbar o casaco de buffy, e diluir o plasma com um volume equivalente de PBS, até 7,5 mililitros.Em seguida, adicione cuidadosamente o tampão de lise de glóbulos vermelhos à amostra de sangue, a um volume final de 30 mililitros, e inverta suavemente o tubo de coleta de sangue três vezes, antes de colocar o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos. No final da incubação, colete as células por centrifugação, e remova cuidadosamente todos, exceto os últimos quatro a cinco mililitros de supernascedor. Use uma micropipette filtrada para remover o supernatante restante e use uma micropipette P1000 com uma ponta filtrada para adicionar um mililitro de tampão de resuspensão na parede do tubo.Para evitar a introdução de bolhas, resuspenja a pelota celular com tubulação suave, até que a amostra seja homogênea. Quando a pelota for resuspended, adicione mais três mililitros de tampão de ressuspensão na parede do tubo, sem introduzir bolhas, e misture suavemente as células novamente. Para o enriquecimento celular tumoral de 50 mililitros em espiral, carregue primeiro um novo chip microfluido espiral no dispositivo e carregue um tubo vazio de centrífuga de 50 mililitros em cada uma das portas de entrada e saída.Clique no prime para preparar o dispositivo microfluido em espiral por três minutos. Removendo os tubos de entrada e saída no final do ciclo. Carregue a amostra de sangue resuspended na porta de entrada e carregue um tubo cônico claro de 15 mililitros na porta de saída.Em seguida, clique em executar e selecione programa três para iniciar o programa de enriquecimento de células tumorais que circulam 31 minutos. No final do ciclo, transfira o tubo de saída para a centrífuga, e use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para remover todos, exceto os dois últimos mililitros do supernatante. Em seguida, use uma micropipette para remover todos, exceto os últimos 100 microliters de supernacer.Para coloração de imunofluorescência, conte as células em um hemocitometro e dilua a amostra enriquecida para uma única célula de dez a cinco células por 100 microlitadores de concentração de solução anti-vinculação de 0,2%. Em seguida, use um cotonete encharcado com 50 microliters de solução anti-vinculação para umedecer o contorno da câmara de amostra, e coloque um deslizamento de vidro de polilise na câmara de amostra. Feche a câmara, e pipeta para cima e para baixo três vezes para revestir uma ponta de micropipette com a solução de ligação antes de reutilizar a amostra nos últimos 100 microliters do supernante.Transfira a solução celular para a câmara de amostra e citospin a amostra em uma centrífuga dedicada a 400 rotações por minuto durante quatro minutos, em uma aceleração baixa. No final da centrifugação, coloque um isolador de silicone ao redor da área de deposição e deixe o slide secar sob um armário de segurança microbiológica por dois minutos, em seguida, fixar a amostra citospun com 100 microliters de 4% paraformaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido por três lavagens de dois minutos com 200 microliters de PBS por lavagem, à temperatura ambiente. Após a última lavagem, bloqueie qualquer ligação não específica com incubação de 30 minutos no bloqueio do reagente à temperatura ambiente, seguido de rotulagem com 100 microliters da solução de anticorpos de interesse.Coloque o slide rotulado em uma placa de petri de 100 por 15 mililitros em um pedaço de papel absorvente umedecido com dois mililitros de água estéril, e coloque a placa fechada, a quatro graus Celsius durante a noite, protegida da luz. Na manhã seguinte, lave a amostra três vezes com PBS como demonstrado, e monte a amostra com 10 microliters de uma solução de montagem apropriada e um deslizamento de tampa de vidro. Em seguida, sele o deslizamento da tampa com esmalte claro.Para imaginar as amostras citospun, carregue o slide em um microscópio fluorescente reto com uma plataforma motorizada X Y, e selecione um objetivo de 20x e os canais apropriados de acordo com os fluoroforos usados para a rotulagem de anticorpos. Ligue a lâmpada de mercúrio e adapte o microscópio e o software associado a uma filmagem semiautomática. Quando a lâmpada estiver pronta, no menu de aquisição, defina os quatro canais, defina o tempo de exposição e defina as telhas para digitalizar.Clique em ladrilhos e experimento avançado e defina a área para digitalizar. Em seguida, ajuste o foco na tela e clique em iniciar o experimento. No final do experimento, exporte os arquivos TIF para cada canal e nomeie especificamente o arquivo para incluir a amostra, número de vezes, corante e número de sub-telhas.Para análise de imagens, abra o software de análise de imagens do site do Broad Institute e clique em arquivo, pipeline de arquivos e análise de quatro canais CTC. Solte arquivos na lista de arquivos e atualize os metadados para agrupar os arquivos por telhas. Em seguida, clique em analisar imagens para abrir o arquivo da planilha correspondente aos parâmetros de intensidade da medida.Sem o protocolo de descontaminação otimizado, a alta contaminação bacteriana é observada nas culturas teciduais de linhas celulares A549 enriquecidas após apenas 24 horas, causando morte e alterações citomorfológicas nas células eucarióticas. Em contrapartida, após o protocolo de limpeza, as células A549 vivas são obtidas em culturas 2D após 10 horas de cultura tecidual e remoção média, sob condições de cultura 3D e dentro de amostras de pacientes. Utilizando um ensaio de coloração imunofluorescente líquido ou um ensaio de coloração imunofluorescente em lâminas revestidas de polilise com citospina, pode-se observar uma clara distinção no número de núcleos enumerados entre os dois ensaios.Sem o passo do citospino, é difícil diferenciar os glóbulos brancos das células tumorais, devido aos contornos embaçados nos preps celulares não citospin. Aqui podem ser observados diferentes achados representativos de diferentes amostras de pacientes, com a contagem residual dos glóbulos brancos, em particular, determinada a ser fortemente variável, e dependente de toda a amostra de sangue. Também foi observada alta variabilidade nas subsu populações de células tumorais circulantes obtidas.Cada célula no citospin é identificada pelo software de análise de imagens, e permite o rastreamento de células e manualmente para confirmar os resultados conforme necessário. De fato, uma análise piloto demonstrou uma concordância entre a enumeração manual e a enumeração do software de análise de imagens. A configuração da placa de petri úmida projetada internamente para a hibridização proteína-anticorpo é fundamental, pois o dispositivo permanece suficientemente úmido durante todo o tempo de incubação.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Pesquisa do câncer

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ortotópico transplante de células de Adenocarcinoma de pulmão Syngeneic para estudar a expressão de PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...