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July 27th, 2019
DOI :
July 27th, 2019
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Title
1:41
Designing Inverse Primers and Selecting Restriction Enzymes (Bioinformatics)
5:56
Making Circular DNA Templates for Long-distance Inverse PCR: DNA Extraction and Quality Assessment
8:29
Long-distance Inverse PCR: Determining Primer Annealing Temperature by Gradient PCR
10:25
Representative Results of LDI-PCR
11:27
Conclusion
Transcript
यह विधि लाइन-1एस नामक रेट्रोट्रांसपोजिशन की गतिविधि का पता लगा सकती है। ये मोबाइल आनुवंशिक तत्व कैंसर जीनोम में डी नोवो सम्मिलन का कारण बनते हैं और इस प्रकार जीनोमिक अस्थिरता में योगदान देते हैं। पीसीआर आधारित इस तकनीक का लाभ यह है कि यह उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोणों की तुलना में सरल और लागत प्रभावी है।
हम यहां डी नोवो सम्मिलन का पता लगाने में अपनी उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं जो मानव गुणसूत्र 22 पर टीटीसी28 जीन के अंदर एक लाइन-1 से उत्पन्न होता है। लाइन-1 गतिविधि विशेष रूप से एपिथेलियल ट्यूमर प्रकारों में द्रोह या पूर्व-द्रोह के लिए बायोमार्कर के रूप में काम कर सकती है, जैसे पेट के कैंसर या उच्च ग्रेड सीरस ओवेरियन कैंसर। लाइन-1 सम्मिलन के अलावा, यह विधि अन्य जीनोमिक विपथनों का पता लगा सकती है, जैसे डीएनए पुनर्व्यवस्थाओं जिन्हें हमेशा एक कारण के लिए पुनर्व्यवस्था की आवश्यकता होती है।
एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम का चयन करने के लिए, और व्युत्क्रम प्राइमर डिजाइन करने के लिए, सबसे पहले, एक LINE-1 डेटाबेस, जैसे L1Base से FASTA प्रारूप में TTC28 LINE-1 अनुक्रम डाउनलोड करें । टीटीसी28 लाइन-1 के लिए एल1बेस आईडी 135 है। पांच किलोबेस अनुक्रम शामिल करें, दोनों पांच प्रधानमंत्री और तीन प्रधानमंत्री, लाइन-1 अनुक्रम के अंत flanking ।
एक शब्द प्रोसेसर के लिए अनुक्रम निर्यात। यहां लाइन-1 फ्लैंकिंग सीक्वेंस को ब्राउन फॉन्ट और लाइन-1 सीक्वेंस में ग्रे फॉन्ट में एनोटेट किया गया है। टीटीसी28 लाइन-1 के तीन प्राइम के डाउनस्ट्रीम में एक किलोबेस अनुक्रम में अद्वितीय टैग निर्धारित करने के लिए और पॉलीएडक्यू या ड्रैगन पॉलीए स्पॉटर जैसे पॉलीडेनिलेशन सिग्नल भविष्यवाणी उपकरणों में से एक में।
इस एक किलोबेस विंडो में सभी पॉलीएडेनिलेशन सिग्नल को एनोटेट करें। टीटीसी28 LINE-1 के अपने कमजोर पॉलीएडेनिलेशन सिग्नल के बीच अनुक्रम गुलाबी रंग में यहां प्रकाश डाला गया और सबसे मजबूत पॉलीएडेनिलेशन सिग्नल डाउनस्ट्रीम इस लाइन-1 का अनूठा टैग है जो यहां पीले रंग में हाइलाइट किया गया है । व्युत्क्रम पीसीआर प्राइमर डिजाइन करने के लिए एक वेब-आधारित प्राइमर डिजाइनिंग टूल में अद्वितीय टैग अनुक्रम दर्ज करें, जैसे एनसीबीआई के प्राइमर-ब्लास्ट जो विशिष्ट पीसीआर प्राइमर उत्पन्न करता है, प्राइमर जोड़े दिखाने के लिए उत्पाद की लंबाई पैरामीटर को न्यूनतम रखें एक दूसरे के करीब हैं।
उपयुक्त जीनोम डेटाबेस का चयन करें। प्राइमर ब्लास्ट का आउटपुट एक दूसरे का सामना करने वाले पारंपरिक पीसीआर प्राइमर उत्पन्न करता है, इसलिए प्रिमर जोड़ी के लिए रिवर्स पूरक फ़ंक्शन का उपयोग उलटा पीसीआर करने के लिए करें। जब भी संभव हो, पूर्व पॉलीडेनिलेशन सिग्नल के अनुरूप इंटर-डिजाइन प्राइमर।
हम तीन प्राइमर जोड़े, चैती और हरे रंग में प्रकाश डाला, TTC28 LINE-1 के अद्वितीय टैग में तीन मजबूत पॉलीडेनिलेशन संकेत के अनुरूप है । इसके बाद, एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम का चयन करने के लिए, लाइन-1 अनुक्रम को पचाने के साथ-साथ सिलिका में अपने पांच किलोबेस अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम फ्लैंक के साथ वेब-आधारित उपकरणों का उपयोग करके, जैसे कि प्रतिबंधमैपर। यह प्रतिबंध एंजाइमों की एक व्यापक सूची देगा जो इस कारण को पचाता है, विभिन्न प्रतिबंध टुकड़े पैदा करता है।
प्रतिबंध एंजाइमों का चयन करें जो लाइन-1 के पांच प्राइम एंड के पांच प्राइम अपस्ट्रीम या लाइन-1 के पांच प्राइम एंड की ओर करते हैं, अगर यह लाइन-1 के भीतर ही है । और एक तीन प्राइम कार्ड अद्वितीय टैग से ऊपर बहाव । लाइन-1 अनुक्रम के साथ देशी प्रतिबंध टुकड़ा और चयनात्मक प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा बनाया गया इसका अनूठा टैग, 12 किलोबेस से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह पीसीआर द्वारा कुशलता से परिलक्षित नहीं किया जा सकता है।
ध्यान दें कि चयनात्मक प्रतिबंध एंजाइम डीएनए मिथाइलेशन के प्रति असंवेदनशील होंगे, गर्मी-निष्क्रिय होना चाहिए, और चिपचिपा सिरों को उत्पन्न करना चाहिए जो एक दूसरे के पूरक हैं। लंबी दूरी के व्युत्क्रम पीसीआर को प्रदर्शित करने के लिए, हम SacI प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करेंगे जो प्रकाश हरे रंग में यहां हाइलाइट किए गए DAZCTC साइटों पर डीएनए में कटौती करता है। SacI TTC28 LINE-1 लोकस में सभी मानदंडों को पूरा करता है और 5, 700 आधार जोड़े का एक देशी प्रतिबंध टुकड़ा उत्पन्न करता है।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके नमूनों से जीनोमिक डीएनए निकालें जो लंबी दूरी की विपरीत पीसीआर के लिए आवश्यक अच्छी गुणवत्ता, उच्च आणविक डीएनए निकालने में सक्षम है। यहां हमने निर्माण के निर्देश का उपयोग करके MCF7 स्तन कैंसर सेल लाइन और सामान्य मानव रक्त से जीनोमिक डीएनए निकाला है। फ्लोरोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को मापें।
डीएनए की गुणवत्ता और मात्रा की जांच करने के लिए एक व्यक्ति पर १०००० नैनोग्राम डीएनए एक डीएनए आणविक वजन मार्कर के साथ जेल पैदा हुआ । परिपत्र डीएनए टेम्पलेट बनाने के लिए, पहले उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम के साथ डीएनए पचा। यहां हम MCF7 को पचाने के लिए SacI का उपयोग करते हैं और रक्त जीनोमिक डीएनए टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार पाचन प्रतिक्रिया मिश्रण बनाते हैं।
ट्यूब और अपकेंद्रित्र को संक्षेप में फ्लिक करके समाधान मिलाएं। निर्माता के निर्देश के अनुसार, गर्मी निष्क्रियता के बाद एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, पचाए गए डीएनए को स्वयं-लिगेट करने के लिए टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार एक लिगेशन रिएक्शन मास्टर मिक्स समाधान करें।
प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, इस लिगाशन रिएक्शन मास्टर के 30 माइक्रोलीटर सीधे पिछले चरण से पचा डीएनए समाधान के 50 माइक्रोलीटर के लिए जोड़ें। ट्यूब को फ्लिक करके समाधान मिलाएं और ट्यूब को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें। 10 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकिलर में इस प्रतिक्रिया मिश्रण इनक्यूबेट, एक और 10 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी निष्क्रियता कदम के साथ खत्म ।
इस परिपत्र डीएनए टेम्पलेट का उपयोग बाद के व्युत्क्रम पीसीआर चरण में किया जाएगा। ढाल पीसीआर द्वारा इष्टतम प्राइमर एनीलिंग तापमान निर्धारित करने के लिए थर्मल साइकिलर में एक एनीलिंग तापमान ढाल निर्धारित करें। टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार सभी कंपोनेंट्स को मिलाकर और मिक्स करके पीसीआर के लिए मास्टर मिक्स तैयार करें।
ढाल में प्रत्येक एनीलिंग तापमान के लिए एक प्रतिक्रिया निर्धारित करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, मास्टर मिक्स पीसीआर ट्यूबों के 19 माइक्रोलीटर आवंटित करें और रक्त जीनोमिक डीएनए से उत्पन्न परिपत्र डीएनए टेम्पलेट का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। रेडिएंट पीसीआर प्रोग्राम चलाएं।
पीसीआर उत्पाद के छह माइक्रोलीटर चलाएं, इसे एगरल्ड जेल में एक कोर्स में अलग-अलग एनीलिंग तापमान पर गर्म करें। एमसीएफ7 सेल लाइन के जीनोम में डी नोवो टीटीसी28 लाइन-1 रेट्रोट्रांसशन गतिविधि का पता लगाने के लिए, एमसीएफ-7 सेल लाइन से उत्पन्न परिपत्र डीएनए टेम्पलेट्स पर व्युत्क्रम प्राइमर जोड़ी का उपयोग करके पीसीआर करें। ढाल पीसीआर के लिए के रूप में एक ही निर्देश का पालन करें, लेकिन इस बार इष्टतम एनीलिंग तापमान है, जो ६४ डिग्री सेल्सियस है के साथ तापमान ढाल की जगह ।
परिणामों के लिए एगर उठे जेल द्वारा लंबी दूरी के विलोम पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें। इलेक्ट्रोफोरेस के बाद ली गई इस एगर उठे जेल छवि से पता चलता है कि एमसीएफ 7 से निकाले गए जीनोमिक डीएनए और रक्त के नमूनों में उच्च आणविक वजन होता है, जिससे यह लंबी दूरी की व्युत्क्रम पीसीआर के लिए उपयुक्त हो जाता है। इलेक्ट्रोफोरेस के बाद ली गई इस एगर उठे जेल छवि से पता चलता है कि हमने जो व्युत्क्रम प्राइमर जोड़ी डिजाइन की है, वह ढाल में सभी एनीलिंग तापमान पर सही परिपत्र टेम्पलेट को बढ़ाती है जैसा कि 5 किलोबेस और सात किलोबेस डीएनए मार्कर के बीच तीव्र अवधि द्वारा मनाया जाता है।
हालांकि, विभिन्न बैंड भी कम तापमान पर मनाया जाता है, जो खराब प्राइमर विशिष्टता और खराब एनीलिंग तापमान का संकेत देता है। इस प्रकार, इस प्राइमर जोड़ी के लिए, 64 डिग्री सेल्सियस इष्टतम एनीलिंग तापमान है। यह एगर उठे जेल छवि MCF7 सेल लाइन और सामान्य रक्त से निकाले गए डीएनए पर लंबी दूरी के व्युत्क्रम पीसीआर प्रदर्शन के बाद प्राप्त पीसीआर उत्पाद को दिखाती है।
5, 700 बेस जोड़े का पीसीएफ उत्पाद, जो एक तारक द्वारा चिह्नित है, अपने मूल लोकस पर लाइन-1 के अनुरूप मूल पीसीआर का प्रतिनिधित्व करता है। यह देशी पीसीआर उत्पाद एमसीएफ7 और सामान्य रक्त डीएनए दोनों में दिखाई देता है। डी नोवो लाइन-1 रेट्रोट्रांसपोशन और एमसीएफ7 जीनोम विभिन्न आकारों के पीसीआर उत्पाद के रूप में पता लगाने योग्य है, साथ ही एग्राज्ड जेल में देशी पीसीआर उत्पाद के साथ।
एकल आणविक लंबे समय से पढ़ा अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों द्वारा लंबी दूरी की उलटा पीसीआर उत्पाद अनुक्रमण एक परमाणु तंग संकल्प में लक्ष्य पहचान की पहचान की अनुमति कर सकते हैं । हालांकि लंबी दूरी के उलट पीसीआर उत्पाद का एक बोझिल दृष्टिकोण, क्लोनिंग और सेंगर अनुक्रमण भी संभव है। इस वीडियो में क्रोमोसोम 22 पर एक लाइन-1 की गतिविधि का पता चला।
एक ही कार्यप्रवाह को अन्य लाइन-1s की निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो विभिन्न ट्यूमर प्रकारों में सक्रिय हैं।
यह लेख एक सक्रिय लाइन-1 retrotransposon की गतिविधि पर नजर रखने के लिए और किसी दिए गए जीनोम में de नोवो retrotranspositions नक्शा करने के लिए एक सरल पीसीआर आधारित परख रूपरेखा. MCF7 सेल लाइन का उपयोग करके, हम यहाँ प्रदर्शित कैसे इस विधि एक लाइन-1 22Q12.1 पर स्थित की गतिविधि का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है.
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