Denne metoden kan oppdage aktiviteten til etteroverstår kalt LINE-1s. Disse mobile genetiske elementene forårsaker de novo innsettinger i kreftgenomer og bidrar dermed til genomisk ustabilitet. Fordelen med denne PCR-baserte teknikken er at den er enkel og kostnadseffektiv sammenlignet med sekvenseringsmetoder med høy gjennomstrømning.

Vi demonstrerer her sitt verktøy i å oppdage de novo innsettinger som stammer fra en LINE-1 inne i TTC28 genet på menneskelig kromosom 22. LINE-1 aktivitet kan tjene som biomarkør for malignitet eller pre-malignitet spesielt i epiteltumortyper, som tykktarmskreft eller høyverdig serøs eggstokkreft. Foruten LINE-1 innsettinger, kan denne metoden oppdage andre genomiske avvik, for eksempel DNA-omorganiseringer som alltid trenger omorganisering av en grunn.

For å velge et passende begrensningsenzym, og for å designe inverse primere, laster du først ned TTC28 LINE-1-sekvensen i FASTA-format fra en LINE-1-database, for eksempel L1Base. L1Base-ID-en for TTC28 linje-1 er 135. Inkluder fem kilobaser sekvens, flankerer både fem prime og tre prime, slutten av Line-1 sekvensen.

Eksportere sekvensen til et tekstbehandlingsprogram. Her er linje-1 flanking sekvensen kommentert i brun skrift og linje-1 sekvenser i grå skrift. For å bestemme den unike koden i en kilobasesekvens nedstrøms av TTC28 Line-1s tre prime og inn i en av polyadenylering signal prediksjon verktøy, for eksempel Polyadq eller Dragon PolyA Spotter.

Komnter alt polyadenyleringssignal i dette ene kilobasevinduet. Sekvensen mellom TTC28 LINE-1s eget svake polyadenyleringssignal uthevet her i rosa og det sterkeste polyadenyleringssignalet nedstrøms er den unike koden til denne LINE-1 uthevet her i gult. Hvis du vil designe inverse PCR-primere, angir du den unike kodesekvensen i et nettbasert primerdesignverktøy, for eksempel NCBI's Primer-BLAST som genererer bestemte PCR-primere, hold produktlengdeparameteren til et minimum for å vise at primerpar er nær hverandre.

Velg riktig genomdatabase. Etter hvert som produksjonen av Primer Blast genererer konvensjonelle PCR-primere som vender mot hverandre, bruker du omvendt komplementfunksjon for primerparet til å utføre inverse PCR. Inter-design primere, tilsvarende øst polyadenylering signal når det er mulig.

Vi har deigned tre primer par, uthevet i blågrønn og grønn, tilsvarende tre sterke polyadenylering signal i den unike koden til TTC28 LINE-1. Deretter, for å velge en passende begrensning enzym, fordøye LINE-1 sekvensen, sammen med sine fem kilobase oppstrøms og nedstrøms flanker i silika ved hjelp av web-baserte verktøy, for eksempel RestrictionMapper. Dette vil gi en omfattende liste over begrensningenzymer som fordøyer denne grunnen, og genererer forskjellige restriksjonsfragmenter.

Velg begrensningsenzymer som gjør en fem prime cut oppstrøms av LINE-1 fem prime end eller mot de fem prime slutten av LINE-1 hvis det er innenfor LINE-1 selv. Og et tre hovedkort nedstrøms opp fra den unike koden. Det opprinnelige restriksjonsfragmentet med LINE-1-sekvens og dens unike tag laget av selektive begrensningsenzymer, bør ikke være lengre enn 12 kilobaser, da det kanskje ikke forsterkes av PCR effektivt.

Legg merke til at de selektive begrensningsenzymene ville være ufølsomme for DNA-metylering, bør være varmeinaktiverbare, og bør generere klissete ender som er komplementære til hverandre. For å demonstrere langdistanse inverse PCR, vil vi bruke SacI begrensning enzym som kutter DNA på DAZCTC nettsteder uthevet her i lys grønn. SacI oppfyller alle kriteriene på TTC28 LINE-1 locus og genererer et opprinnelig begrensningsfragment på 5700 basispar.

Trekk ut genomisk DNA fra prøver ved hjelp av kommersielt tilgjengelig DNA-ekstraksjonssett som er i stand til å trekke ut godt kvalitet, høyt molekylært DNA som er nødvendig for langdistanse invers PCR. Her har vi hentet genomisk DNA fra MCF7 brystkreftcellelinje og normalt menneskelig blod ved hjelp av produsentens instruksjon. Mål DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et fluorometer.

100 hundre nanogram DNA på en person agarose gel sammen med en DNA molekylær vekt markør for å sjekke DNA kvalitet og kvantitet. For å lage sirkulære DNA-maler, må du først fordøye DNA med egnet begrensningsenzym. Her bruker vi SacI til å fordøye MCF7 og blod genomisk DNA Lag en fordøyelsesreaksjonsblanding i henhold til tekstprotokollen.

Bland løsningen ved å knipse røret og sentrifuge kort. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 grader Celsius i en time etterfulgt av varmeinaktivering, i henhold til produsentens instruksjon. Deretter lager du en ligation reaction master mix-løsning i henhold til tekstprotokollen for å selv ligate det fordøyde DNA-et.

For hver reaksjon, tilsett 30 mikroliter av denne ligation reaksjon master blanding direkte til 50 mikroliter av fordøyd DNA-løsning fra forrige trinn. Bland løsningen ved å knipse røret og sentrifuge røret kort. Inkuber denne reaksjonsblandingen i en termisk cycler ved 22 grader Celsius i 10 minutter, og avsluttet med et varmeinaktiveringstrinn ved 60 grader Celsius i ytterligere 10 minutter.

Denne sirkulære DNA-malen vil bli brukt i etterfølgende inverse PCR trinn. Still inn en glødende temperaturgradient i en termisk cycler for å bestemme den optimale primer glødetemperaturen ved gradering av PCR. Forbered en hovedblanding for PCR ved å kombinere og blande alle komponentene i henhold til tekstprotokollen.

Sett opp én reaksjon for hver glødetemperatur i graderingen. For hver reaksjon, tildele 19 mikroliter av master mix PCR rør og legge til en mikroliter av sirkulær DNA-mal, generert fra blod genomisk DNA. Kjør graderings-PCR-programmet.

Kjør seks mikroliter pcr-produkt, varm det ved forskjellig glødetemperatur i ett kurs i agarose gel. For å oppdage de novo TTC28 LINE-1 retrotransposition aktivitet i genomet til MCF7 cellelinje, utføre PCR ved hjelp av inverse primer par på sirkulære DNA-maler, generert fra MCF-7 cellelinje. Følg samme instruksjoner som for gradient PCR, men denne gangen erstatte temperaturgradienten med optimal glødetemperatur, som er 64 grader Celsius.

Analyser langdistanse inverse PCR-produkter med agarose gel for resultatene. Dette agarose gel bildet tatt etter en elektroforeser viser genomisk DNA hentet fra MCF7 og blodprøver har høy molekylvekt, noe som gjør det egnet for langdistanse inverse PCR. Dette agarose gel bildet tatt etter elektroforeser viser at den inverse primer par som vi designet forsterker riktig sirkulær mal ved alle glødende temperaturer i gradienten som observert av intens span mellom 5 kilobase og syv kilobase DNA markør.

Imidlertid observeres også ulike bånd ved lavere temperaturer, noe som indikerer dårlig primer spesifisitet og dårlige glødetemperaturer. Dermed, for dette primerparet, er 64 grader Celsius den optimale glødetemperaturen. Dette agarose gel bildet viser PCR produktet innhentet etter å ha utført langdistanse inverse PCR ved DNA hentet fra MCF7 cellelinje og normalt blod.

Et PCF-produkt på 5 700 basispar, merket med en stjerne, representerer den opprinnelige PCR-en som tilsvarer linje 1 på sitt opprinnelige gresshopp. Dette innfødte PCR-produktet er synlig i både MCF7 og normalt blod-DNA. De novo LINE-1 retrotransposisjon og MCF7 genom kan detekteres som PCR-produkt av forskjellige størrelser, sammen med innfødt PCR-produkt i agarose gel.

Sekvensering av det lange inverse PCR-produktet ved hjelp av enkeltmolekylære langleste sekvenseringsteknologier kan tillate identifisering av målidentifikasjon i en kjernefysisk tett oppløsning. Selv om en tungvint tilnærming, kloning og sanger sekvensering av langdistanse inverse PCR produktet er også mulig. I denne videoen ble aktiviteten til en LINE-1 på kromosom 22 oppdaget.

Den samme arbeidsflyten kan tilpasses for å overvåke andre LINE-1s som er aktive i forskjellige tumortyper.

Summary

Explore More Videos

strukturell variasjon