Detektering av Retrotransponering aktivitet av hot LINE-1s med långdistans omvänd PCR

Denna metod kan upptäcka aktiviteten av retrotranspositions kallas LINE-1s. Dessa mobila genetiska element orsakar de novo insertions i cancergenom och bidrar därigenom till genomisk instabilitet. Fördelen med denna PCR-baserade teknik är att den är enkel och kostnadseffektiv jämfört med sekvenseringsmetoder med hög genomströmning.

Vi visar här dess nytta i att upptäcka de novo infogningar som härrör från en LINE-1 inuti TTC28 genen på mänskliga kromosom 22. LINE-1 aktivitet kan fungera som biomarkör för malignitet eller pre-malignitet särskilt i epitelial tumörtyper, som tjocktarmscancer eller höggradig serös äggstockscancer. Förutom LINE-1 infogningar, denna metod kan upptäcka andra genomiska avvikelser, såsom DNA rearrangements som alltid behöver omorganisering av en anledning.

För att välja en lämplig restriktionsenzym, och att utforma omvänd grund- och tvärs, Först, ladda ner TTC28 LINE-1 sekvensen i FASTA-format från en LINE-1 databas, till exempel L1Base. L1Base-ID för TTC28 Line-1 är 135. Inkludera fem kilobases sekvens, flankerande både fem främsta och tre prime, slutet av Line-1 sekvens.

Exportera sekvensen till en ordbehandlare. Här är Line-1 flankering sekvens kommenteras i brunt teckensnitt och Line-1 sekvenser i grått typsnitt. För att bestämma den unika taggen i en kilobase sekvens nedströms TTC28 Line-1: s tre prime och i en av polyadenylation signal förutsägelse verktyg, såsom Polyadq eller Dragon PolyA Spotter.

Kommentera all polyadenylationssignal i detta ett kilobase-fönster. Sekvensen mellan TTC28 LINE-1:s egen svaga polyadenylationssignal som framhävs här i rosa och den starkaste polyadenylationssignalen nedströms är den unika taggen av denna LINE-1 som framhävs här i gult. För att designa inverser PCR primers in i den unika taggen sekvens i en webbaserad primer designverktyg, som NCBI: s Primer-BLAST som genererar specifika PCR primers, hålla parametern produktlängd till minsta för att visa primer par är nära varandra.

Välj lämplig genomdatabas. Eftersom utdata från Primer Blast genererar konventionella PCR-primers mot varandra, använd funktionen för omvänd komplement för primerparet för att utföra invers PCR. Inter-design primers, motsvarande öst polyadenylation signal när det är möjligt.

Vi har deigned tre primer par, markerat i kricka och grönt, motsvarande tre starka polyadenylation signal i den unika taggen av TTC28 LINE-1. Nästa, för att välja en lämplig begränsning enzym, smälta LINE-1 sekvens, tillsammans med sina fem kilobase uppströms och nedströms flanker i kiseldioxid med hjälp av webbaserade verktyg, såsom RestrictionMapper. Detta kommer att ge en omfattande lista över restriktionsenzymer som smälter denna anledning, generera olika begränsning fragment.

Välj restriktionsenzymer som gör en femprimetskuren uppströms LINE-1:s femprime-ände eller mot den fem främsta änden av LINE-1 om den ligger inom själva LINE-1. Och en tre främsta kortet nedströms upp från den unika taggen. Den inhemska begränsning fragment med LINE-1 sekvens och dess unika tagg som gjorts av selektiv begränsning enzymer, bör inte vara längre än 12 kilobases, eftersom det kanske inte förstärks av PCR effektivt.

Observera att de selektiva restriktionsenzymerna skulle vara okänsliga för DNA-metylering, bör vara värmeinaktiva, och bör generera klibbiga ändar som är komplement till varandra. För att demonstrera långväga invers PCR, kommer vi att använda SacI begränsningsenzym som skär DNA på DAZCTC platser markerade här i ljusgrön. SacI uppfyller alla kriterier vid TTC28 LINE-1 locus och genererar en infödd begränsning fragment av 5, 700 baspar.

Extrahera genomiskt DNA från prover med hjälp av kommersiellt tillgängliga DNA extraktionssats som är i stånd att extrahera god kvalitet, högmolekylära DNA nödvändigt för långväga invers PCR. Här har vi extraherat genomiskt DNA från MCF7 bröstcancer cellinje och normalt humant blod med hjälp av tillverkning s instruktion. Mät DNA-koncentrationen med hjälp av en fluorometer.

100 hundra nanogram DNA på en person agaros gel tillsammans med en DNA molekylär vikt markör för att kontrollera DNA-kvalitet och kvantitet. För att göra cirkulära DNA-mallar, först smälta DNA med lämpligt restriktionsenzym. Här använder vi SacI för att smälta MCF7 och blodgenomisk DNA Gör en nedbrytningsreaktionsmix enligt textprotokoll.

Blanda lösningen genom att snärta röret och centrifugerna en kort stund. Inkubera reaktionsmixen vid 37 grader Celsius i en timme följt av värmeinaktivering, enligt tillverkarens instruktion. Därefter gör en ligering reaktion master mix lösning enligt textprotokollet för att självligera den smälta DNA.

För varje reaktion, tillsätt 30 mikroliter av denna ligation reaktion master mix direkt till 50 mikroliter av smält DNA-lösning från föregående steg. Blanda lösningen genom att snärta röret och centrifugera röret en kort stund. Inkubera denna reaktionsblandning i en termisk cycler vid 22 grader Celsius i 10 minuter, avsluta med en värme inaktivering steg vid 60 grader Celsius i ytterligare 10 minuter.

Denna cirkulära DNA-mall kommer att användas i efterföljande invers PCR steg. Ställ in en glödgningstemperaturgradient i en termisk cycler för att bestämma den optimala primerglödgningstemperaturen genom lutnings-PCR. Förbered en huvudmix för PCR genom att kombinera och blanda alla komponenterna enligt textprotokollet.

Ställ in en reaktion för varje glödgningstemperatur i gradienten. För varje reaktion, fördela 19 mikroliter av master mix PCR rör och lägga till en mikroliter av cirkulär DNA-mall, som genereras från blodgenomisk DNA. Kör programmet tonings-PCR.

Kör sex mikroliter av PCR-produkt, värm den vid olika glödgningstemperatur i en kurs i agarosgel. För att upptäcka de novo TTC28 LINE-1 retrotransposition aktivitet i arvsmassan av MCF7 cellinje, utföra PCR med hjälp av invers primer par på cirkulära DNA-mallar, som genereras från MCF-7 cellinje. Följ samma instruktioner som för lutning PCR, men denna gång ersätter temperaturen lutning med optimal glödgning temperatur, som är 64 grader Celsius.

Analysera den långa avstånd inversen PCR produkter genom agaros gel för resultaten. Denna agarosgelbild tagen efter en elektrofores visar det genomiska DNA som extraherats från MCF7 och blodprover har hög molekylvikt, vilket gör den lämplig för långväga invers PCR. Denna agaros gel bild tagen efter elektrofores visar att den omvända primer par som vi utformat förstärker rätt cirkulär mall vid alla glödgning temperaturer i gradienten som observerats av intensiv span mellan 5 kilobase och sju kilobase DNA-markör.

Men, olika band observeras också vid lägre temperaturer, vilket tyder på dålig primer specificitet och dålig glödgning temperaturer. Således, för detta primerpar, 64 grader Celsius är den optimala glödgningstemperaturen. Denna agaros gel bilden visar PCR produkt som erhållits efter att ha utfört långväga invers PCR på DNA extraheras från MCF7 cellinje och normalt blod.

En PCF-produkt på 5, 700 baspar, som markeras av en asterisk, representerar den inhemska PCR som motsvarar Line-1 vid dess inhemska locus. Denna inhemska PCR produkt syns i både MCF7 och normalt blod DNA. De novo LINE-1 retrotransposition och MCF7 genomet är detekterbar som PCR produkt av olika storlekar, tillsammans med inhemska PCR produkt i agaros gel.

Sekvensering av den långväga inversa PCR-produkten genom enkelmolekylär långläst sekvenseringsteknik kan möjliggöra identifieringar av målidentifiering i en kärnsnäv upplösning. Även om en tungrodd strategi, kloning och sanger sekvensering av den långa avstånd invers PCR produkt är också möjligt. I den här videon upptäcktes aktiviteten hos en LINE-1 på kromosom 22.

Samma arbetsflöde kan anpassas för att övervaka andra LINE-1s som är aktiva i olika tumörtyper.