Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת צ'רלס מענקים פרימוס/MED/26, GAUK 1308217 ו-SVV 260310. אנו מודים Ondřej Šebesta לקבלת עזרה עם מיקרוסקופ ופיתוח של צינור ניתוח תמונה. אנו מודים למעבדת הReGenEx לגבי זנים של מחלת ה-s. cerevisiae ס , והפקנט והירורי ניקי, עבור זנים של היפנים . Ppc1-88 זן סופק על ידי מרכז המשאבים הגנטיים שמרים יפן. המיקרוסקופיה בוצעה במעבדה למיקרוסקופיה ומיקרוסקופית הפלואורסצנטית במימון הקרן האירופית לפיתוח האזור ותקציב המדינה של צ'כיה (פרויקט מס '. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 ו-CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. הכנת פתרונות ומדיה
<ol><li>
הכינו פתרון להשומנים.
	<ol>
<li>כדי להכין מלאי השומנים מכתים פתרון התמוססות 10 מ ג של BODIPY 493/503 ב 10 מ ל של הידרואז DMSO (ריכוז סופי 1 מ"ג/mL). מתמוסס את התוכן כולו של 10 מ"ג BODIPY 493/503 בקבוקון כדי למנוע אובדן של חומר במהלך שקילה. זהירות: . DMSO יכול לעבור דרך העור תל...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

הבנת חילוף החומרים של השומנים והרגולציה שלה חשובה הן בביולוגיה הבסיסית והן ביישומים הקליניים והביוטכנולוגיים. תוכן LD מייצג בדיקה נוחה של מצב חילוף החומרים של השומנים של התא, עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית להיות אחת השיטות העיקריות המשמשות לקביעת תוכן LD. הפרוטוקול המוצג מאפשר זיהוי אוטומטי ו?...

שומנים לשחק תפקידים מהותיים באנרגיה התאית פחמן מטבוליזם, סינתזה של רכיבים ממברנה, וייצור של חומרים אקטיביים. חילוף החומרים ליפיד הוא מכוונן בהתאם לתנאי הסביבה, זמינות מזינים ו-מחזור התא שלב1. בבני אדם, חילוף החומרים ליפיד כבר מחובר למחלות, כגון השמנה, סוכרת סוג II וסרטן2. בתעשייה, שומנים שיוצרו על ידי מיקרואורגניזמים, כגון מיאס, מייצגים מקור מבטיח של דלק דיזל מתחדשת3. תאים מאחסנים שומנים ניטרליים ב שנקרא טיפות שומנים בדם (מקרא). הגופים האבולוצדיים הללו מורכבים מטריליגליליפוספלים, אסטרים של שריר, שריר הפוספוליפיד החיצוני וחלבונים משויכים1. המילד מקורם ברשת האנדופלזמית, מחזור התאים או הצמיחה-שלב התפתחות, והם חשובים עבור הומאוסטזיס שומנים סלולריים1. מספר LD ומורפולוגיה ניתן להשתמש כמו פרוקסי נוח כאשר הדבר מטבוליזם השומנים תחת תנאי צמיחה שונים או בעת הקרנת פאנל של מוטציות. בהתחשב האופי הדינמי שלהם, טכניקות מסוגל לנתח את המאפיינים של האדם היחיד מתעניין מחקרים של מטבוליזם השומנים.
מינים שמרים שונים שימשו לתיאור מסלולים מטבולית הקשורים השומנים ואת הרגולציה שלהם, או בשימוש ביוטכנולוגיה לייצר תרכובות מעניינות או דלקים1. יתר על כן, עבור מודלים של מודל, כגון שמרים לבקוע cerevisiae ס או הקשורים ביקוע הקשורות שמרים שיניים, הגנום-רחב מחיקה הספריות זמינים כי ניתן להשתמש עבור תפוקה גבוהה מסכי4,5. לאחרונה LD קומפוזיציה ודינמיקה תוארו ב -S. ביקוע6,7,8,9, מוטציות הקשורות חילוף החומרים השומנים כבר מבודדים במודל המתעוררים שמרים . כן.
טכניקות רבות זמינות כדי ללמוד תוכן LD ודינמיקה. רוב להעסיק סוג כלשהו של כתמים של המכונה עם ליפופילית צבעים כגון הנילוס אדום או BODIPY 493/503. האחרון מראה עירור צר יותר ספקטרום פליטה, ו מוגברת ספציפיות לעבר שומנים ניטרליים (המכונה) לעומת פוספוליפידים (ממברנות)11. פלואורימטריה וזרימה-cytometry שיטות שימשו בהצלחה מינים פטרייתיים שונים כדי לחשוף גנים ותנאי גדילה המשפיעים על אחסון השומנים תוכן12,13,14,15. בעוד ששיטות אלה מתאימות יישומים בעלי תפוקה גבוהה, הם אינם יכולים למדוד את המספרים ואת המבנה של התעודות הזהות הבודדות בתאים, אשר יכולים להיות שונים באופן דרמטי בין תנאי גדילה לבין גנוטיפים. פיזור ראמאן קוהרנטי או מיקרוסקופ הולוגרפי דיגיטלי הן שיטות ללא תווית המפיקות נתונים ברמת LD, אך דורשות ציוד יקר מיוחד16,17,18. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית, מצד שני, יכול לספק נתונים מפורטים על תוכן LD, תוך שימוש נפוץ מכשירים וניתוח תמונה כלי התוכנה. קיימות מספר זרימות עבודה של ניתוח התכונות דרגות שונות של תחכום ואוטומציה בזיהוי תא/LD מנתוני תמונה, והם ממוטבים עבור סוגי תאים שונים, כגון תאים מטזובן עם מזהה גדול19,20 , , עשריםושבעה. חלק מגישות אלה פועלות רק ב-2D (לדוגמה, בתמונות הקרנה מרביות), שעשויות להיכשל באופן מהימן בתיאור התוכן התאי של ה-LD. לידיעתך, לא קיימים כלים לקביעת תוכן LD ומורפולוגיה מנתונים מיקרוסקופיים שמרים ביקוע. פיתוח של ניתוח ברמת LD אוטומטי וחסון יביא רגישות מוגברת ועוצמה סטטיסטית משופרת, ולספק מידע עשיר על תוכן ניטרלי השומנים, באופן אידיאלי במינים שמרים מרובים.
פיתחנו זרימת עבודה עבור ניתוח תוכן LD מתוך 3D תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של תאים שמרים. תאים חיים מוכתמים עם BODIPY 493/503 ו דטרן כחול מדורגת כדי להמחיש התעודות ולקבוע גבולות התא, בהתאמה. תאים הם מקיבוע על שקופיות זכוכית נתון הדמיה z-מחסנית באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצלי סטנדרטי. התמונות מעובדות לאחר מכן על-ידי צינור אוטומטי מיושם ב-MATLAB, חבילה נפוצה (מסחרית) עבור ניתוחים סטטיסטיים. הצינור מבצע עיבוד מקדים של תמונה, פילוח (תאים לעומת רקע, הסרת תאים מתים) ו-LD זיהוי. נתונים עשירים ברמת LD, כגון גודל LD ועוצמת קרינה, מסופקים לאחר מכן בתבנית טבלאית התואמת לכלי תוכנה מרכזיים בגיליון אלקטרוני. זרימת העבודה שימש בהצלחה כדי לקבוע את ההשפעה של זמינות מקור חנקן על חילוף החומרים לשומנים ב -S. ביקוע24. כעת אנו מדגימים את הפונקציונליות של זרימת העבודה ב -s. ביקוע, s. הפקוניקוס ו -s. cerevisiae ס, באמצעות תנאי צמיחה או מוטציות המשפיעות על תוכן LD סלולרי.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

חילוף החומרים ליפיד והרגולציה שלה הם בעלי עניין הן בסיסיות והן מדעי החיים המוחלים וביוטכנולוגיה. בהקשר זה, מינים שמרים שונים משמשים כמודלים במחקר חילוף חומרים לשומנים או לייצור השומנים התעשייתי. טיפות השומנים הם גופי אחסון דינאמי מאוד והתוכן הסלולרי שלהם מייצג הבדיקה נוח של מצב מטבולית השומנים. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא שיטה של בחירה עבור ניתוח כמותי של טיפות שומנים סלולריים, כפי שהוא מסתמך על ציוד זמין נרחב מאפשר ניתוח של טיפות שומנים בודדים. יתר על כן, ניתוח תמונה מיקרוסקופיים יכול להיות אוטומטי, הגדלת מאוד התפוקה הכוללת הניתוח. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה ניסיונית ואנליטית עבור זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בודדות בשלושה מינים שונים של שמרים מודל: ביקוע שיאת הביקוע ו . והשמרים השיכחויות טיפות ליפידים הם דמיינו עם bodipy 493/503, ו תוספי תא-הניאון מתווסף למדיית התרבות כדי לעזור לזהות גבולות התא. תאים חשופים למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית תלת-ממדית בערוצים ירוקים וכחולים והתמונות של מחסנית z מעובדות באופן אוטומטי על-ידי צינור MATLAB. ההליך פלט נתונים כמותיים עשיר על השומנים הסלולר תוכן droplet ומאפיינים בודדים droplet השומנים בפורמט טבלאי מתאים ניתוח במורד הגיליון האלקטרוני או חבילות סטטיסטיות. אנו מספקים למשל ניתוחים של שומנים בתוכן droplet בתנאים שונים המשפיעים על חילוף החומרים של השומנים הסלולריים.

ההליך כולו מסוכם באיור 1 עבור ביקוע (זרימת העבודה של שמרים מדומה מקבילה), ומתחת אנו מספקים דוגמאות לאופן שבו ניתן להשתמש בזרימת העבודה כדי ללמוד תוכן LD בשלוש זנים שמרים שונים בתנאים שונים הידועים להשפיע על תוכן LD סלולרי. כל דוגמה מייצגת ניסוי ביולוגי אחד.
<p class="jove_content" fo:keep...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

פרוטוקול זה מאפשר ניתוחים כמותיים בקנה מידה קטן עד גדול של תוכן השומנים באחסון התאים במגוון מיני שמרים והוא עושה זאת בצורה לא משוחדת ומתקנת. הטכניקה מאפשרת עיבוד מהיר של תמונות מיקרוסקופיות ומספקת יציאות כמותיות מפורטות כדי להשוות בקלות דגימות כגון מוטנטים ותאים שונים הגדלים בתנאים מגוונים. כדי להתחיל, בצע בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי להכין את פתרונות הכתמים, המדיה התרבותית והתאים.ודא כי התאים בריאים בשלב הצמיחה הרצוי לפני הפעלת הניסוי. לאחר מכן, הכינו כיסוי מיקרוסקופ כדי שכל דגימה תדמיין. מורחים מיקרוליטר אחד של פתרון ציפוי שקופיות על גבי כיסוי נקי באמצעות הצד הארוך של קצה פיפסה במיקום אופקי.אפשר לפתרון הציפוי להתייבש לחלוטין, ולאחר מכן אחסן את הכיסויים בסביבה נטולת אבק. לאחר מכן, למדוד את הצפיפות האופטית של תרבויות התא, ועל תרבויות להיות מנותח באותו שלב הצמיחה, לנסות להגיע לערכים דומים בין כל התרבויות שנבדקו כדי להבטיח תנאים ניסיוניים דומים. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של תרבות התא לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.עבור תאי S.cerevisiae בלבד, להוסיף חמישה microliters של פתרון ציפוי שקופית לצינור גם כן. לאחר מכן, בקצרה מערבולת כל צינורות microcentrifuge, ו דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד במשך חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פתרון כתמי השומנים לכל עליקוט תרבות, ומערבולת אותם בקצרה.לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטרים של פתרון הדמיה של גבול התא, ומערבולת אותם לזמן קצר בפעם השנייה. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 1, 000 פעמים כוח הכבידה במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בסיום הסיבוב, הסר 950 מיקרוליטרים מהעל-טבעי ולהשתמש מחדש בתאים בעל-טבעי הנותר באמצעות פיפטה.לאחר מכן, פיפטה שני מיקרוליטרים של ההשעיה התא צפוף על כיסוי מצופה לטין. לאחר מכן, מניחים את הכיסוי על שקופית מיקרוסקופ נקי כדי ליצור monolayer תא, ולהמשיך מיקרוסקופיה מהר ככל האפשר כדי למזער ממצאים בהדמיה. הגדרת המיקרוסקופ דורשת חשיפות ארוכות למקורות אור חזקים העללים לגרום נזק לדגימה ולהטות תוצאות.לכן, להגדיר את תנאי ההדמיה באמצעות שקופית מדגם ייעודי כי לא ישמש עוד יותר עבור כימות טיפת השומנים. מקם את הדגימה הייעודית על הבמה של ניגודיות פאזה או הגדרת מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, והתמקד בתאים. בתוכנת המיקרוסקופ, הגדר את הגדרות מחסנית Z כך שהן ישתרעו על-פני כל אמצעי האחסון של התא.המרחק האנכי הכולל תלוי בגודל התא, ומספר הפרוסות האופטיות תלוי בצמצם המספרי של המטרה. לאחר מכן, הגדר את המוקד כך שזז יחסית למישור המוקד המרכזי. כדי לדמיין טיפות שומנים, הגדר באופן ניסיוני את עוצמת האור ותזמן החשיפה בערוץ הירוק.להיות זהיר בעת הדמיה, כמו BODIPY הוא פלואורוכרום בהיר מאוד שעשוי להיות photobleached במהירות. בנוסף, למזער את זמן החשיפה כדי למנוע תיסה יתר. לכוד תחילה את מחסנית Z בערוץ הירוק המלא לפני המעבר לערוץ הכחול כדי למנוע טשטוש טיפות השומנים הניידות.לתדמית גבולות תא, קבעו באופן ניסיוני את עוצמת האור ואת זמן החשיפה בערוץ הכחול. במידת האפשר, הגדר ולהשתמש בזרימת עבודה ניסיונית אוטומטית בתוכנת הבקרה של המיקרוסקופ כדי להקל על הדמיה של דגימות מרובות בתנאים סטנדרטיים. חשוב לציין שיש לרכוש את כל התמונות באמצעות אותן הגדרות כדי לאפשר השוואה מתאימה בין דוגמאות.לאחר אופטימיזציה של תנאי ההדמיה, התמקדו בתאים ודמיינו אותם בערוצים הירוקים והכחולים. תמונה שדות תצוגה מרובים לכל דוגמה כדי להשיג נתונים חזקים ומייצגים. שמרו את תמונות הערימה Z בערוץ הכחול והירוק כקובצי TIFF מרובי שכבות של 16 סיביות.הקפד לכלול את המילים ירוק או כחול בשמות הקבצים המתאימים. פתח תמונות מיקרוסקופיות ב- ImageJ, והסר את כל ערימות התמונות המכילות מספר ניכר של תאים שהוזזו במהלך הרכישה. אלה מופיעים במיקומים שונים במקטעי Z בודדים.לאחר מכן, הסר את כל ערימות התמונות המכילות חלקיקים פלואורסצנטיים מאוד שאינם תאים בתעלה הכחולה. זה נגרם לעתים קרובות על ידי לכלוך על משטח ההדמיה או זיהומים במדיום הטיפוח ועשוי להפריע לגילוי תאים בסביבתם. כמו כן, הסר את כל ערימות התמונות המכילות חלק גדול מהתאים המתים.תמונות אלה יציגו תאים עם פלואורסצנטיות כחולה מוגברת בהשוואה לתאים החיים. בעוד נוכחותם של כמה תאים מתים המדגם היא בדרך כלל לא בעיה ותאים אלה נמחקים באופן אוטומטי במהלך הניתוח, כמה תאים מתים או גוססים עשויים מדי פעם להיות מזוהים כתאים חיים על ידי אלגוריתם פילוח ובכך להטות את התוצאות שדווחו. כדי להתחיל בניתוח ב- MATLAB, צור תחילה תיקיה ראשית והעתק את כל קבצי ה- Script של MATLAB למיקום זה.לאחר מכן, צור תיקיות משנה עם השמות של מיני השמרים השונים, והעתק את תמונות TIFF המתאימות למיקומים אלה. עכשיו, להתחיל MATLAB, לפתוח את התסריט הראשי. ותריץ את התסריט.בתפריט, בחר את מיני השמרים שיש לנתח והתחל בעיבוד תמונה. בדוק ועיבד את קבצי הפלט כנדרש באמצעות עורך גיליון אלקטרוני או חבילה סטטיסטית. זרימת העבודה מפיקה קבצי CSV מופרדים באמצעות נקודה-פסיק וקבצי TIFF מקופלים עם אובייקטי תא שזוהו ו טיפות שומנים.מוצגים כאן תאי S.pombe מסוג פראי שגודלו במדיום YES המורכב או במדיום EMM המוגדר. בהשוואה לתאים הגדלים במדיום YES, זוהו פחות טיפות שומנים ועוצמת כתמים גבוהה יותר ליחידת נפח תאים במדיום EMM. יתר על כן, טיפות שומנים בודדים שנוצרו במדיום EMM היו גדולים יותר והוצגו בעוצמת כתמים כוללת מוגברת.זאת בהסכמה עם ממצאים קודמים של תוכן שומנים מאוחסן מוגבר בתאים הגדלים ב- EMM. לאחר מכן, תמונות אלה מראות תאי S.japonicus מתרבויות אקספוננציאליות ותחילת נייחות גדל במדיום כן. תאים שנכנסו לשלב נייח הראו ירידה ניכרת במספר טיפות השומנים ליחידת נפח התאים, בעוד שעוצמת פלואורסצנטיות טיפת השומנים מנורמלת בנפח ירדה מעט בין שני התנאים.טיפות השומנים הראשונות בשלב נייח היו בדרך כלל גדולות יותר במתינות בגודלן ועוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת גבוהה למדי בהשוואה ל טיפות מתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי. בתאי S.cerevisiae שגדלו לשלב אקספוננציאלי לעומת נייח, תאים נייחים הכילו מעט פחות טיפות שומנים ליחידת נפח בהשוואה לתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי. עם זאת, עוצמת פלואורסצנטיות טיפה מנורמל נפח שלהם כמעט הוכפל.עלייה חדה זו בתתוכן טיפת השומנים הכולל נבעה מעוצמת פלואורסצנטיות גבוהה בהרבה ונפח של טיפות שומנים בודדים בשלב נייח. בעקבות הליך זה, ניתן לצבור נתוני פלט בחבילה סטטיסטית כגון R כדי ליצור התוויות של תוצאות מסוכמות ולהפעיל בדיקות סטטיסטיות על כל ההבדלים שנצפו בתוכן טיפת השומנים. באופן עקרוני, צינור עיבוד התמונה יכול לשמש לניתוח של תוכן טיפת השומנים במיקרואורגניזמים אחרים או לנתח מבנים תת-תאיים אחרים דמויי נקודה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

גישה אוטומטית-למחצה הכנת קוקטיילי נוגדן עבור ניתוח Immunophenotypic של אדם דם היקפי

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...