Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Universidade Charles concede PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 e SVV 260310. Agradecemos a Ondřej Šebesta pela ajuda com microscopia e desenvolvimento do pipeline de análise de imagem. Agradecemos ao laboratório ReGenEx por cepas de s. cerevisiae e ao laboratório Japonet e Hironori Niki para cepas de s. japonicus . A cepa custos ppc1-88 foi fornecida pelo centro de recursos genéticos de levedura do Japão. A microscopia foi realizada no laboratório de microscopia confocal e de fluorescência cofinanciada pelo Fundo Europeu de desenvolvimento regional e pelo orçamento do estado da República Tcheca (projeto n º CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 e CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. preparação de soluções e mídia
<ol><li>
Prepare a solução de coloração lipídica.
	<ol>
<li>Para preparar a solução de coloração lipídica de estoque dissolva 10 mg de BODIPY 493/503 em 10 mL de DMSO anidro (concentração final de 1 mg/mL). Dissolva todo o conteúdo de um frasco para injetáveis de 10 mg BODIPY 493/503 para evitar a perda de material durante a pesagem. Atenção: DMSO pode passar através da pele. Use equipamento de proteção individual apropriado....

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

A compreensão do metabolismo lipídico e sua regulação é importante tanto para a biologia básica, quanto para aplicações clínicas e biotecnológicas. O teor de LD representa uma leitura conveniente do estado de metabolismo lipídico da célula, sendo a microscopia de fluorescência um dos principais métodos utilizados para determinação do teor de LD. O protocolo apresentado permite a deteção automatizada e a descrição quantitativa de LDs individuais em três espécies diferentes e morfològica distintas do...

Os lipídios desempenham papéis cruciais na energia celular e no metabolismo do carbono, na síntese dos componentes da membrana e na produção de substâncias bioativas. O metabolismo lipídico é ajustado de acordo com as condições ambientais, a disponibilidade de nutrientes e a fase1do ciclo celular. Nos seres humanos, o metabolismo lipídico tem sido ligado a doenças, tais como obesidade, diabetes tipo II e câncer2. Na indústria, os lipídios produzidos por microrganismos, como leveduras, representam uma fonte promissora de combustíveis diesel renováveis3. As células armazenam lipídios neutros nas chamadas gotículas lipídicas (LDs). Estes corpos evolutivamente conservados são compostos de triacilgliceróis, ésteres de esterilo, monocamada fosfolipídica externa e proteínas associadas1. Os LDs se originam no retículo endoplasmático, exercem dinâmicas de ciclo celular ou de fase de crescimento e são importantes para a homeostase lipídica celular1. O número e a morfologia do LD podem ser usados como um proxy conveniente ao ensaio o metabolismo do lipido várias condições de crescimento ou ao selecionar um painel dos mutantes. Dada a sua natureza dinâmica, as técnicas capazes de analisar as propriedades dos LDs individuais são de particular interesse em estudos de metabolismo lipídico.
Várias espécies de leveduras têm sido usadas para descrever as vias metabólicas relacionadas a lipídios e sua regulação, ou usadas em biotecnologia para produzir compostos ou combustíveis interessantes1. Além disso, para leveduras modelo, como a levedura brotamento Saccharomyces cerevisiae ou o fermento de fissão distante relacionados Schizosaccharomyces pombe, bibliotecas de deformação de exclusão de todo o genoma estão disponíveis que podem ser usados para alta taxa de transferência telas4,5. Recentemente a composição e a dinâmica do LD foram descritas em S. pombe6, 7,8,9, e os mutantes relativos ao metabolismo lipídico foram isolados no fermento modelo emergente Schizosaccharomyces japonicus10.
As técnicas numerosas estão disponíveis para estudar o índice e a dinâmica do LD. A maioria emprega algum tipo de coloração de LDs com corantes lipofílicos como o Nilo vermelho ou BODIPY 493/503. Este último apresenta espectros de excitação e emissão mais estreitos e especificidade aumentada em relação aos lipídios neutros (LDs) em oposição aos fosfolipídeos (membranas)11. Métodos fluimétricos e de fluxo-citometria têm sido utilizados com sucesso em várias espécies fúngicas para descobrir genes e condições de crescimento que afetam o conteúdo lipídico do armazenamento12,13,14,15. Embora esses métodos sejam adequados para aplicativos de alta taxa de transferência, eles não podem medir os números e a morfologia de LDs individuais nas células, o que pode diferir drasticamente entre as condições de crescimento e os genótipos. A dispersão coerente de Raman ou a microscopia holográfica digital são métodos Label-Free que produzem dados do LD-nível, mas exigem o equipamento caro especializado16,17,18. A microscopia de fluorescência, de um lado, pode fornecer dados detalhados no índice do LD, ao utilizar instrumentos geralmente disponíveis e ferramentas de software da análise de imagem. Existem vários fluxos de trabalho de análise que apresentam vários graus de sofisticação e automação na detecção de células/LD a partir de dados de imagem, e são otimizados para tipos de células diferentes, como células metazoários com grandes LDS19,20 , 21, ou leveduras de brotamento17,22,23. Algumas dessas abordagens só funcionam em 2D (por exemplo, em imagens de projeção máxima), o que pode não conseguir descrever de forma confiável o conteúdo de LD celular. A nosso conhecimento, nenhumas ferramentas existem para a determinação do índice do LD e da morfologia dos dados microscópicos da levedura da fissão. O desenvolvimento de análises automatizadas e robustas de nível LD traria maior sensibilidade e maior poder estatístico, e forneceria informações ricas sobre o teor de lipídios neutros, idealmente em várias espécies de leveduras.
Desenvolvemos um fluxo de trabalho para análise de conteúdo de LD a partir de imagens de microscopia de fluorescência 3D de células de levedura. Células ao vivo são manchadas com BODIPY 493/503 e Cascade Blue dextrano para visualizar os LDs e determinar os limites das células, respectivamente. As células são imobilizadas em lâminas de vidro e submetidas à imagem de pilha z usando um microscópio de epifluorescência padrão. As imagens são então processadas por um pipeline automatizado implementado no MATLAB, um pacote amplamente utilizado (comercial) para análises estatísticas. O pipeline realiza pré-processamento de imagens, segmentação (células versus fundo, remoção de células mortas) e identificação de LD. Os dados ricos do LD-nível, tais como o tamanho do LD e a intensidade da fluorescência, são fornecidos então em um formato tabular compatível com as ferramentas de software principais da folha de cálculo. O fluxo de trabalho foi utilizado com sucesso para determinar o impacto da disponibilidade da fonte de nitrogênio no metabolismo lipídico em S. pombe24. Agora Demonstramos a funcionalidade do fluxo de trabalho em s. pombe, s. japonicus e s. cerevisiae, usando condições de crescimento ou mutantes que afetam o conteúdo de LD celular.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

O metabolismo lipídico e seu regulamento são de interesse para as Ciências da vida básica e aplicada e biotecnologia. A este respeito, várias espécies de leveduras são usadas como modelos na pesquisa metabólica lipídica ou para a produção de lipídios industriais. Gotículas lipídicas são corpos de armazenamento altamente dinâmicos e seu conteúdo celular representa uma leitura conveniente do estado metabólico lipídico. A microscopia de fluorescência é um método de escolha para a análise quantitativa de gotas lipídicas celulares, pois depende de equipamentos amplamente disponíveis e permite a análise de gotas lipídicas individuais. Além disso, a análise de imagem microscópica pode ser automatizada, aumentando consideravelmente a taxa de transferência geral. Aqui, nós descrevemos um fluxo de trabalho experimental e analítico para a deteção automatizada e a descrição quantitativa de gotas lipídicas individuais em três espécies modelo diferentes do fermento: as leveduras da fissão Schizosaccharomyces pombe e Schizosaccharomyces japonicus, e o fermento brotamento Saccharomyces cerevisiae. As gotas do lipido são visualizadas com BODIPY 493/503, e o dextrano fluorescente Cell-impermeable é adicionado aos meios de cultura para ajudar a identificar limites da pilha. As células são submetidas à microscopia de epifluorescência 3D em canais verdes e azuis e as imagens de pilha z resultantes são processadas automaticamente por um pipeline MATLAB. O procedimento produz dados quantitativos ricos sobre o conteúdo de gotas lipídicas celulares e características individuais de gotas lipídicas em um formato tabular adequado para análises a jusante em grandes planilhas ou pacotes estatísticos. Nós fornecemos exemplos de análises de conteúdo de gotículo lipídico várias condições que afetam o metabolismo lipídico celular.

Todo o procedimento é resumido na Figura 1 para as leveduras de fissão (o fluxo de trabalho de levedura de brotamento é análogo), e abaixo fornecemos exemplos de como o fluxo de trabalho pode ser usado para estudar o conteúdo de LD em três diferentes espécies de leveduras várias condições conhecidas afetar o conteúdo da LD celular. Cada exemplo representa um experimento biológico único.
<img alt="Figure 1" class="xfigi...

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Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Aqui, apresentamos uma implementação de MATLAB de detecção automatizada e descrição quantitativa de gotas lipídicas em imagens de microscopia de fluorescência de fissão e brotamento de células de levedura.

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Este protocolo facilita análises quantitativas de pequeno a grande porte do conteúdo lipídado de armazenamento celular em uma variedade de espécies de leveduras e o faz de forma imparcial e padronizada. A técnica permite o processamento rápido de imagens microscópicas e fornece saídas quantitativas detalhadas para comparar facilmente amostras como vários mutantes e células cultivadas em diversas condições. Para começar, acompanhe o protocolo de texto que acompanha as soluções de coloração, mídia cultural e células.Certifique-se de que as células estão saudáveis e na fase de crescimento desejada antes de executar o experimento. Em seguida, prepare uma mancha de microscópio para que cada amostra seja imageda. Espalhe um microliter de solução de revestimento deslizante em uma tampa limpa usando o lado longo de uma ponta de pipeta posicionada horizontalmente.Deixe a solução de revestimento secar completamente e, em seguida, armazene as tampas em um ambiente sem poeira. Em seguida, medir as densidades ópticas das culturas celulares, e para que as culturas sejam analisadas na mesma fase de crescimento, tente alcançar valores semelhantes entre todas as culturas testadas para garantir condições experimentais comparáveis. Então, pipeta um mililitro da cultura celular em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Somente para as células S.cerevisiae, adicione cinco microliters da solução de revestimento de slides ao tubo também. Em seguida, brevemente vórtice todos os tubos de microcentrifuuge, e incuba-los a 30 graus Celsius com agitação por cinco minutos. Em seguida, adicione um microliter da solução de coloração lipídica a cada alíquota de cultura, e vórtice-los brevemente.Em seguida, adicione 10 microliters da solução de visualização do limite celular, e o vórtice-os brevemente uma segunda vez. Colete as células centrifugando-as a 1.000 vezes a gravidade por três minutos à temperatura ambiente. Quando terminar de girar, remova 950 microliters do supernascer e resuspense as células no restante do supernatante usando uma pipeta.Em seguida, pipeta dois microliters da densa suspensão celular em um deslizamento revestido de lectina. Em seguida, coloque a mancha de cobertura em um slide de microscópio limpo para formar uma monocamada celular, e prossiga para microscopia o mais rápido possível para minimizar artefatos em imagens. A configuração do microscópio requer longas exposições a fontes de luz fortes que podem causar danos à amostra e distorcer resultados.Portanto, configure as condições de imagem usando um slide de amostra dedicado que não será mais utilizado para quantificação de gotículas lipídicas. Coloque a amostra dedicada no estágio de uma configuração de microscópio de contraste de contraste de fase ou interferência diferencial e foque nas células. No software do microscópio, defina as configurações de pilha Z para que elas abrangem todo o volume celular.A distância vertical total depende do tamanho da célula, e o número de fatias ópticas depende da abertura numérica do objetivo. Em seguida, defina o foco para mover-se em relação ao plano focal central. Para imagens de gotículas lipídicas, ajuste experimentalmente a intensidade da luz e o tempo de exposição no canal verde.Tenha cuidado ao fotografar, pois o BODIPY é um fluorocromo muito brilhante que pode ser rapidamente fotobleachado. Além disso, minimize o tempo de exposição para evitar a supersaturação. Capture o canal verde z-stack primeiro antes de mudar para o canal azul para evitar desfocar as gotículas lipídicas móveis.Para os limites das células de imagem, defina experimentalmente a intensidade da luz e o tempo de exposição no canal azul. Se possível, configure e use um fluxo de trabalho experimental automatizado no software de controle de microscópio para facilitar a imagem de várias amostras em condições padronizadas. É importante ressaltar que todas as imagens devem ser adquiridas usando as mesmas configurações para permitir a comparação adequada entre as amostras.Uma vez otimizadas as condições de imagem, concentre-se nas células e as imagem nos canais verde e azul. Imagem múltiplos campos de exibição por amostra para obter dados robustos e representativos. Salve as imagens Z-stack do canal azul e verde como arquivos TIFF multicamadas de 16 bits.Certifique-se de incluir as palavras verde ou azul nos nomes de arquivo correspondentes. Abra imagens microscópicas no ImageJ e remova quaisquer pilhas de imagens contendo um número considerável de células que se moveram durante a aquisição. Estes aparecem em posições diferentes em seções individuais Z.Em seguida, remova todas as pilhas de imagens que contenham partículas não-celulares altamente fluorescentes no canal azul. Isso é frequentemente causado por sujeira na superfície de imagem ou impurezas no meio de cultivo e pode interferir na detecção de células em suas proximidades. Além disso, remova quaisquer pilhas de imagens que contenham uma grande proporção de células mortas.Essas imagens exibirão células com fluorescência azul aumentada em comparação com as células vivas. Embora a presença de algumas células mortas na amostra não seja tipicamente um problema e essas células sejam automaticamente descartadas durante a análise, algumas células mortas ou moribundas podem ocasionalmente ser reconhecidas como células vivas pelo algoritmo de segmentação e, portanto, distorcer os resultados relatados. Para começar a análise no MATLAB, primeiro crie uma pasta principal e copie todos os scripts MATLAB para este local.Em seguida, crie subpastas com os nomes das várias espécies de leveduras e copie as respectivas imagens TIFF para esses locais. Agora, inicie o MATLAB, abra o script PRINCIPAL. m, e executar o script.No menu, selecione as espécies de leveduras a serem analisadas e inicie o processamento da imagem. Inspecione e processe os arquivos de saída conforme necessário usando um editor de planilhas ou um pacote estatístico. O fluxo de trabalho produz arquivos CSV separados por ponto e vírgula e arquivos TIFF segmentados com objetos celulares detectados e gotículas lipídicas.São mostradas aqui células S.pombe do tipo selvagem que foram cultivadas no complexo meio YES ou no meio EMM definido. Em comparação com as células cultivadas no meio YES, foram detectadas menos gotículas lipídicas e maior intensidade de coloração por unidade de volume celular no meio EMM. Além disso, as gotículas lipídicas individuais formadas no meio EMM foram maiores e apresentaram maior intensidade total de coloração.Isso está de acordo com os achados anteriores do aumento do conteúdo lipídudo armazenado em células cultivadas em EMM. Em seguida, essas imagens mostram células S.japonicus de culturas exponenciais e estacionárias primitivas cultivadas em meio SIM. As células que entraram em fase estacionária mostraram um número significativamente reduzido de gotículas lipídicas por unidade de volume celular, enquanto a intensidade de fluorescência de gotículas lipídicas normalizada em volume diminuiu ligeiramente entre as duas condições.As gotículas lipídicas de fase estacionária inicial eram tipicamente moderadamente maiores em tamanho e tinham intensidade de fluorescência total moderadamente maior em comparação com gotículas de células em crescimento exponencial. Em S.cerevisiae as células cresceram para fase exponencial versus estacionária, as células estacionárias continham um pouco menos gotículas lipídicas por unidade de volume em comparação com células em crescimento exponencial. No entanto, sua intensidade de fluorescência de gotícula normalizada em volume quase dobrou.Este aumento acentuado no teor geral de gotículas lipídicas deveu-se à intensidade de fluorescência muito maior e ao volume de gotículas lipídicas individuais em fase estacionária. Após este procedimento, os dados de saída podem ser agregados em um pacote estatístico como R para criar parcelas de resultados resumidos e executar testes estatísticos sobre quaisquer diferenças observadas no conteúdo de gotículas lipídicas. Em princípio, o pipeline de processamento de imagens pode ser usado para análise de conteúdo de gotículas lipídicas em outros microrganismos ou para analisar outras estruturas subcelulares semelhantes a ponto.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Imunologia e Infecção

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Determinação de estruturas moleculares de glicoproteínas do envelope HIV usando Cryo-Electron Tomografia e Média Sub-tomogram Automated

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Facilitar Drug Discovery: um ensaio automatizado de alta Inflamação conteúdo em Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolamento, processamento e análise de células gengivais murino

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Uma abordagem automatizada-Semi Preparando Antibody Cocktails para Análise imunofenotípica de Sangue Periférico Humano

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...