Onderzoekers hebben eerder gegenereerd recombinant influenza virussen die ofwel fluorescerende of bioluminescente eiwit verslaggevers uitdrukken. Een deel van onze enige expressie van reporter genen in influenza virus ernstig beperkt het gebruik ervan in experimenten. Ons protocol beschrijft het gebruik van bireporter influenza virus dat zowel fluorescerend als bioluminescent reporter genen uitdrukt, en dus overtreft de beperking ervan.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van één recombinant influenzavirus voor in vitro en in vivo studies. Bij het uitvoeren van deze techniek is een snelle injectie van luciferase substraat en een goede planning van muizenbehandeling belangrijk, omdat het substraat snel wordt gemetaboliseerd. Ook wordt het scheren van muizen aanbevolen om de detectie van bioluminescent signaal te verbeteren.
Om de muizen te infecteren, begin met het voorbereiden van de BIRFLU in 1X PBS. Houd het virus op ijs tot inenting. Controleer op de afwezigheid van de teenknijpreflex om ervoor te zorgen dat de muis verdoofd is en inentuleer deze intranasaal met de voorbereide BIRFLU verdunning.
Zorg ervoor dat alle muizen goed ademen voordat ze terugkeren naar hun kooien. Open de beeldsoftware en druk op Initialiseren en stel vervolgens de parameters in die voor de beeldvorming worden gebruikt. Om de muizen die besmet zijn met BIRFLU te controleren, scheert u hun borst om de detectie van het bioluminescente signaal te verbeteren.
Zodra de muizen zijn verdoofd, gebruik dan een 22-meter naald om retro-orbitaal toedienen 100 microliters van Nluc luciferase substraat, verdund een tot 10 in PBS. Plaats de dieren onmiddellijk na de injectie in de isolatiekamer met hun borst naar boven gericht. Plaats vervolgens de isolatiekamer in het beeldinstrument, sluit de deur en verwerf beelden.
Na beeldvorming, breng de muizen terug naar hun kooien en controleer ze totdat ze volledig hersteld zijn. Gebruik de imaging software ROI tool om de verworven bioluminescentie gegevens te analyseren door het aanwijzen van een regio van belang en klikken maatregel. Om ex vivo beeldvorming van muislongen uit te voeren, verzamelt u de longen volgens de aanwijzingen van het manuscript, start u de software voor het verkrijgen van afbeeldingen en stelt u de parameters voor beeldvorming in.
Zodra de machine is geïnitialiseerd, plaats de longen in een zwarte achtergrond lade, en ervoor te zorgen dat de weefsels worden gescheiden van elkaar. Introduceer de lade in de imager, sluit de deur en verwerf afbeeldingen. Na beeldvorming, verwijder de weefsels onmiddellijk en bewaar ze op ijs op vier graden Celsius als de monsters zullen worden verwerkt op dezelfde dag.
Als ze later worden verwerkt, vries ze snel in een buis op droogijs, en bewaar ze op 80 graden Celsius. Als u de afbeeldingen wilt verwerken, selecteert u het hulpprogramma ROI, trekt u interessegebieden rond elk van de afzonderlijke longen en klikt u op meten. BIRFLU is in vitro gekenmerkt door het bepalen van Venus, Nluc en NP expressieniveaus in geïnfecteerde cellen.
Venus en Nluc expressie worden alleen gedetecteerd in cellen besmet met BIRFLU, terwijl NP wordt uitgedrukt in zowel wild-type PR8 en BIRFLU-geïnfecteerde cellen. Er wordt geen expressie waargenomen in met de nep geïnfecteerde cellen. Bovendien is de Activiteit van Nluc gemeten in weefselkweeksupernatants op 24, 48, 72 en 96 uur na infectie.
Het wordt gedetecteerd zo vroeg als 24 uur na infectie, en de expressie niveaus toenemen op 96 uur. Het kan ook worden aangetoond dat replicatiekinetiek van BIRFLU vergelijkbaar is met het wild-type PR8-virus. BIRFLU heeft de mogelijkheid om zowel fluorescerende als bioluminescente reportergenen uit te drukken, en de correlatie tussen de twee kan worden beoordeeld met behulp van in vivo en ex vivo beeldvorming van een muislong.
De longen van muizen besmet met BIRFLU vertoonde hoge bioluminescentie in vivo en fluorescentie ex vivo. Virale titers en genetische stabiliteit van BIRFLU in vivo zijn ook vastgesteld. Plaque testen op de virussen uit de muis longen bleek dat het virus plaques kan vormen en uitdrukken beide verslaggever genen.
BIRFLU kan ook worden gebruikt om de effectiviteit van antivirale en neutraliserende antilichamen tegen influenza te evalueren. De output van deze tests waren allemaal gecorreleerd met elkaar en zijn snel en gemakkelijk te doen.
