연구원은 이전에 형광 또는 생물 발광 단백질 리포터중 하나를 표현하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 생성했습니다. 인플루엔자 바이러스에 있는 기자 유전자의 우리의 단 하나 발현의 일부는 실험에 있는 그것의 사용을 가혹하게 제한합니다. 우리의 프로토콜은 형광 및 생물 발광 기자 유전자를 모두 표현하는 bireporter 인플루엔자 바이러스의 사용을 설명하고, 따라서 그것의 한계를 극복합니다.
이 기술의 주요 장점은 시험관 내 및 생체 내 연구를 위한 단일 재조합 인플루엔자 바이러스의 사용입니다. 이 기술을 수행 할 때, 기판이 신속하게 대사되기 때문에 루시파라기 기판과 마우스 처리의 적절한 계획의 신속한 주입이 중요하다. 또한, 생암발신호의 검출을 개선하기 위해 마우스의 면도가 권장된다.
마우스를 감염시키기 위하여는, 1X PBS에 있는 BIRFLU를 준비하여 시작합니다. 예방 접종까지 얼음에 바이러스를 유지합니다. 발가락 핀치 반사의 부재를 확인하여 마우스가 마취되었는지 확인하고 준비된 BIRFLU 희석으로 인트라나틱하게 접종하십시오.
모든 마우스가 케이지로 돌아오기 전에 제대로 호흡하고 있는지 확인하십시오. 이미징 소프트웨어를 열고 초기화를 누은 다음 이미징에 사용되는 매개 변수를 설정합니다. BIRFLU에 감염된 마우스를 모니터링하려면 가슴을 면도하여 생물 발광 신호의 검출을 개선합니다.
마우스가 마취되면 22 게이지 바늘을 사용하여 22 게이지 바늘을 사용하여 PBS에서 1-10까지 희석된 Nluc luciferase 기판100 마이크로리터를 레트로 궤도로 투여합니다. 주사 직후, 동물을 격리 챔버에 놓고 가슴이 위를 향합니다. 그런 다음, 이미징 기기에 격리 챔버를 놓고 문을 닫고 이미지를 수집합니다.
이미징 후 마우스를 케이지로 돌려보내 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 이미징 소프트웨어 ROI 도구를 사용하여 관심 영역을 지정하고 측정을 클릭하여 획득한 생물 발광 데이터를 분석합니다. 마우스 폐의 전 생체 내 이미징을 수행하려면 원고 방향에 따라 폐를 수집하고 이미지 수집 소프트웨어를 시작하고 이미징을 위한 매개 변수를 설정합니다.
기계가 초기화되면 폐를 검은 색 배경 트레이에 놓고 조직이 서로 분리되었는지 확인합니다. 트레이를 이미저에 소개하고 문을 닫고 이미지를 수집합니다. 이미징 후, 샘플을 같은 날 처리할 경우 조직을 즉시 제거하고 섭씨 4도에서 얼음에 보관하십시오.
나중에 처리될 경우 드라이 아이스의 튜브에 빠르게 얼리고 섭씨 80도에 보관하십시오. 이미지를 처리하려면 ROI 도구를 선택하고 각 개별 폐 주위에 관심 영역을 그리고 측정을 클릭합니다. BIRFLU는 감염된 세포에서 금성, Nluc 및 NP 발현 수준을 결정함으로써 시험관내에서 특징지어지고 있다.
금성과 Nluc 발현은 BIRFLU에 의해 감염된 세포에서만 검출되며, NP는 야생형 PR8 및 BIRFLU 감염 세포 모두에서 발현된다. 모의 감염된 세포에서는 발현이 관찰되지 않습니다. 더욱이, Nluc 활동은 24, 48, 72 및 96 시간 감염 후 조직 배양 초월제에서 측정되었습니다.
감염 후 24시간 일찍 검출되고, 발현 수준은 96시간으로 증가한다. 또한 BIRFLU의 복제 역학이 야생 형 PR8 바이러스와 비교할 수 있음을 입증 할 수 있습니다. BIRFLU는 형광 및 생물 발광 기자 유전자를 모두 발현할 수 있는 능력을 가지며, 둘 사이의 상관관계는 마우스 폐의 생체 내 및 전 생체 이미징을 사용하여 평가될 수 있다.
BIRFLU에 감염된 마우스의 폐는 생체 내 의 높은 생체 발광및 형광 전 생체 내의 비보를 표시하였다. 생체 내에서 BIRFLU의 바이러스 성 티터 및 유전 적 안정성도 결정되었습니다. 마우스 폐에서 바이러스에 플라크 분석 바이러스플라인 플라크는 바이러스가 플라크를 형성하고 기자 유전자를 모두 표현할 수 있음을 보여주었다.
BIRFLU는 또한 인플루엔자에 대하여 항 바이러스 및 중화 항체의 효력을 평가하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 이 에세이의 출력은 모두 서로 상관 관계가 있었고 빠르고 쉽게 할 수 있습니다.
