由于M细胞在肠道中稀有，缺乏对M细胞在肠道平衡和免疫防御中的作用的充分了解。在人类肠道干细胞衍生培养物中诱导M细胞分化，将有助于研究M细胞的发育和功能。要涂覆Transwell膜，请将所需数量的Transwell放在24孔板中，从而创建一个两室系统。
在冷无菌磷酸盐缓冲盐水中稀释细胞外基质或 ECM 25 倍。然后，将100微升的冷稀释溶液加入到膜上。用盖子盖住 24 孔板，将板放入 37 摄氏度的组织培养箱中两个小时，使 ECM 在膜上凝固。
两小时后，从培养箱中取出盘子，放在组织培养罩中。使用无菌钳子，反转每个Transwell，轻轻去除剩余的溶液。在收集细胞时，让膜在盖子打开时在发动机罩中风干。
从培养箱中取出石肠板，通过真空吸气或移液器轻轻地从每一个井中取出培养膜。要分解 ECM，请将 500 微升的冰冷 0.5 毫摩尔 EDTA 添加到每个井中，每个井中含有悬浮在 ECM 中的气体肠。用 P1000 移管器在 500 微升时大力上下移液，以分解 ECM，从而将二角体进入溶液中。
将溶液从每孔收集到 15 毫升锥形管中。在140G和4摄氏度的离心机中，将细胞取出5分钟。颗粒应可见，但可以很容易地脱落，因此通过真空吸气或移液器缓慢去除上流液。
为了消化紧密的结接连结，将二角体分解成单细胞，每收集5口井，将颗粒重新在500微升室温三辛中。使用 P1000 移液器，上下移液器对团块进行分解。在37摄氏度的水浴中孵育管子5分钟或更少。
添加一毫升先进的DMEM F-12与10%FPS每500微升的尝试性，以灭活的尝试性。P1000 在 500 微升时向上和向下移液，对锥形管的侧面至少 50 次，以进一步将剩余的团块分解为单个细胞。将 40 微米电池过滤器放在 50 毫升锥形管上，并加入 1 毫升先进的 DMEM F-12，用 10%FPS 将细胞过滤器弄湿。
将单细胞悬浮液从15毫升圆锥体移到过滤器上。用10%FPS用一毫升先进的DMEM F-12清洗过滤器。将通过细胞过滤器的细胞从50毫升圆锥管转移到一个新的15毫升圆锥管中。
使用血细胞计计算细胞。在室温下，将新15毫升管中的细胞在400G下离心5分钟。细胞颗粒应可见。
用移液器小心地取出上流液，再次保存上流液，以防颗粒脱落。在 MCMGF 中重新注入细胞颗粒，并加上 10 微摩尔 Y27632。确保 ECM 编码的膜已完全干燥，经眼睛评估。
用 200 微升 MCMGF plus 清洗上腔。然后，在每个上腔中加入200微升的细胞溶液。在每个下腔中加入 700 微升 MCMGF 加 10 微摩尔 Y27632。
将板放在 37 摄氏度的组织培养培养箱中，具有 5% CO2。经过一天的生长，从上腔室取出介质，并更换200微升的新鲜MCMGF加，以防止多个细胞层的生长。一旦单层是大约80%的汇合，通常在播种后一天到三天之间，用分化介质代替罗勒边介质，用于控制井，或用M细胞介质进行M细胞诱导井。
在两种条件下，用分化介质更换上室中的介质。要通过 QRTPCR 验证 M 细胞分化，请先从上腔室和底部室取出介质。用 300 微升室温 PPS 轻轻清洗上腔两次。
在每个上腔中加入300微升的TRIzol，并在室温下孵育5分钟。同时，为每口井贴上微离心管的标签，并在每口井中加入700微升的TRIzol。使用P1000轻轻上下移液三次，收集细胞均质，将内化物转移到相应的微离心管中。
漩涡五秒钟混合。将样品保持室温三分钟，然后继续执行标准的 QRTPCR 协议，或将样品储存在负 80 摄氏度。要通过免疫荧光验证M细胞分化，首先，从上室取出介质。
用 300 微升室温 PBS 轻轻清洗两次。在 PBS 中加入 100 微升室温 4%PFA 到上室室。用铝箔盖住盘子，在室温下站立25分钟。
去除 PFA 后，用 300 微升室温 PBS 清洗上室室三次。在室温下，用100微升5%BSA的微升孵育单层，在室温下在黑暗中30分钟，以阻断单层，然后取出溶液。在PBS中1%BSA中，以1至100的稀释量准备GP2原抗体溶液，每井加入100微升。
在黑暗中室温下染色一小时，然后取出溶液。用 300 微升室温 PBS 清洗上腔三次。准备荧光标记山羊抗小鼠IgG phaloidin和DAPI的二次染色溶液，每井添加100微升。
在黑暗中室温下染色30分钟。用300微升PBS洗井三次。然后，在玻璃幻灯片上放置五微升的安装溶液。
从 24 个井板中拆下井，然后反转。在从Transwell上去除膜时，膜必须保持完全平坦。膜中的凹凸可防止密封在玻璃上，并极大地影响图像质量。
为确保成功，请用锋利的手术刀小心地从井中切开膜。将膜与细胞朝上，放在玻璃滑梯上的安装溶液液滴上。在膜的顶部和中心添加 10 微升安装溶液，并在顶部放置盖滑，以密封玻璃滑动和盖滑之间的膜。
在黑暗中室温下干燥滑梯24小时。M细胞通过免疫荧光体GP2的表面表达检测。通常，在汇合单层中，在给定显微镜场中观察到一到五个 M 细胞，放大倍数为 40 倍，在用 RANKL 和 TNF alpha 处理的样品中，在播种后第 6 天到 8 天。
未经处理的样品中未看到 GP2 表达。用 phaloidin 探针覆盖的 XZ 平面的正交视图显示了每个细胞周围的作用因子结构，以及 M 细胞的平面上的 GP2 表达式。此模型概括了人类肠道中 M 细胞的低频。
为了确定该模型中开发的 M 细胞是否能够与 IgA 结合，使用荧光结合二级抗体来可视化 M 细胞上的 IgA，该二次抗体可识别人类血清 IgA 的重链。使用IgA治疗一小时的M细胞将IgA与面图结合，而控制井中的M细胞仅使用IgA的二级抗体进行处理，没有可检测信号。此外，IgA 专门与 M 细胞的面体结合，并且未发现与任何缺乏 GP2 表面污渍的细胞结合。
此外，M细胞的脂肪表面具有特征较短的致密作用素。当单层在80%汇合时切换到 RANKL TNF alpha 补充分化介质，是实现良好M细胞分化的关键。这项技术将使研究人员能够探索与M细胞发育有关的问题，以及宿主病原体相互作用和涉及M细胞的药物传输研究。
