8.2K Views
•
11:34 min
•
July 26th, 2019
DOI :
July 26th, 2019
•0:04
Title
0:27
Inducing M Cell Differentiation in Human Ileal Enteroid-derived Monolayers
5:46
Verifying M Cell Differentiation
9:30
Results: Immunofluorescence of M Cells in Human Ileal Enteroid-derived Monolayers
11:05
Conclusion
Transcript
En fuld forståelse af den rolle, M-celler spiller i tarmhomostase og immunforsvar mangler, på grund af sjældenheden af M-celler i tarmen. Induceret differentiering af M-celler i humane tarmstamceller afledte kulturer vil give mulighed for undersøgelse af M celle udvikling og funktioner. At belægge Transwell membraner, placere det ønskede antal Transwells i en 24 brønd plade, hvilket skaber en to kammer system.
Fortyndes den ekstracellulære matrix, eller ECM, 25 gange i kold steril fosfat buffered saltvand. Derefter tilsættes 100 mikroliter koldfortyndet opløsning i hvert øvre kammer på membranen. Dæk den 24 brøndplade med låg, og læg pladen i en vævskulturinkubator ved 37 grader Celsius i to timer for at tillade ECM-størkning på membranen.
Efter to timer fjernes pladen fra kuvøsen, og den i en vævskulturhætte. Brug sterile pincet, invertere hver Transwell til forsigtigt at fjerne resterende opløsning. Lad membranerne lufte i emhætten med låget åbent, mens cellerne indsamles.
Fjern pladen af ileal enteroids fra inkubatoren, og fjern forsigtigt kulturmediet fra hver brønd ved vakuumaspiration eller med en pipette. For at bryde op ECM, tilføje 500 mikroliter af iskold 0,5 millimolar EDTA til hver brønd, der indeholder ileal enteroids suspenderet i ECM. Pipette op og ned kraftigt med en P1000 pipetter indstillet til 500 mikroliter til at bryde op ECM, og dermed frigive ileal enteroids i opløsningen.
Opløsningen opsaml fra hver brønd i 15 milliliter koniske rør. Pellet cellerne i en centrifuge ved 140G og fire grader Celsius i fem minutter. Pellet skal være synlig, men kan let løsnes, så langsomt fjerne supernatant ved vakuum aspiration eller med en pipette.
At fordøje stramme junction forbindelser og bryde op ileal enteroids i enkelte celler, resuspend pellet i 500 mikroliter af stuetemperatur trypsin pr hver fem brønde indsamlet. Ved hjælp af en P1000 pipetter, pipette op og ned for at opdele klumper. Inkuber rørene i et 37 grader Celsius vandbad i fem minutter eller mindre.
Tilføj en milliliter avanceret DMEM F-12 med 10% FPS pr. 500 mikroliter trypsin for at inaktivere trypsin. Pipette op og ned med en P1000 sat til 500 mikroliter mindst 50 gange mod siden af det koniske rør for yderligere at opdele resterende klumper i enkelte celler. Anvend en 40 mikrocellesti mere end et konisk rør på 50 milliliter, og der tilsættes en milliliter avanceret DMEM F-12 med 10% FPS for at våd celles sien.
Pipette den encellede suspension fra 15 milliliter konisk på sern. Siven vaskes med en milliliter avanceret DMEM F-12 med 10% FPS. Overfør de celler, der gik gennem cellestænten fra det 50 milliliter koniske rør, til et nyt 15 milliliter konisk rør.
Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Centrifuge cellerne i det nye 15 milliliterrør ved 400G i fem minutter ved stuetemperatur. Cellepellet skal være synlig.
Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette, og lagring af supernatanten igen, hvis pellets løsnes. Resuspend cell pellet i MCMGF plus med 10 mikromolar Y27632. Sørg for, at ECM-kodede membraner er helt tørret som vurderet af øjet.
Vask det øverste kammer med 200 mikroliter MCMGF plus. Derefter tilsættes 200 mikroliter celleopløsning i hvert øverste kammer. Tilføj 700 mikroliter MCMGF plus med 10 mikromolar Y27632 til hvert underkammer.
Placer pladen i en 37 grader Celsius væv kultur inkubator med 5% CO2. Efter en dag med vækst, fjerne medierne fra det øverste kammer, og erstatte med 200 mikroliter af frisk MCMGF plus for at forhindre vækst af flere cellelag. Når monolag er ca 80% sammenløb, normalt mellem dag en til tre post såning, erstatte basilateral medier med differentiering medier for kontrol brønde, eller med M celle medier til M celle induktion brønde.
Erstat mediet i det øverste kammer med differentieringsmedier til begge forhold. Hvis du vil kontrollere M-celledifferentiering efter QRTPCR, skal du først fjerne mediet fra øvre og nederste kamre. Vask forsigtigt det øverste kammer to gange med 300 mikroliter af stuetemperatur PPS.
Tilsæt 300 mikroliter TRIzol til hvert øvre kammer, og inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. I mellemtiden, label mikro centrifuge rør for hver brønd, og tilsæt 700 mikroliter TRIzol til hvert rør. Celler homogeniseres ved forsigtigt at pipettere op og ned tre gange med en P1000, og indholdet overføres til tilsvarende mikrocentrifugerør.
Vortex i fem sekunder at blande. Hold prøverne ved stuetemperatur i yderligere tre minutter, og fortsæt derefter med standard QRTPCR-protokoller, eller opbevar prøverne ved negative 80 grader Celsius. For at kontrollere M celle differentiering ved immunfluorescens, først skal du fjerne medierne fra det øverste kammer.
Vask forsigtigt to gange med 300 mikroliter af rumtemperatur PBS. Tilsæt 100 mikroliter af stuetemperatur 4% PFA i PBS til det øverste kammer. Dæk pladen med folie og lad stå i 25 minutter ved stuetemperatur.
Efter fjernelse af PFA vaskes det øverste kammer tre gange med 300 mikroliter rumtemperatur PBS. Der inkuberes monolag med 100 mikroliter på 5% BSA opløst i PBS i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur for at blokere monolag, før opløsningen fjernes. Forbered GP2 primære antistofopløsning i en procent BSA i PBS ved en fortynding af en til 100, og tilsæt 100 mikroliter pr. brønd.
Pletten i en time ved stuetemperatur i mørke, før opløsningen fjernes. Vask det øverste kammer tre gange med 300 mikroliter af rumtemperatur PBS. Forbered en sekundær plet opløsning af fluorescerende mærkede ged anti-mus IgG phalloidin og DAPI, og tilsæt 100 mikroliter pr brønd.
Pletten i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Vask brøndene tre gange med 300 mikroliter PBS. Derefter placere en fem microliter dråbe monteringsopløsning på et glas dias.
Fjern brønden fra de 24 brøndplade og invertere. Under fjernelse af membranen fra Transwell skal membranen forblive helt flad. Bump i membranen forhindre en fast forsegling til glasset dias, og kan i høj grad påvirke billedkvaliteten.
For at sikre succes, omhyggeligt skære membranen fra brønden ved hjælp af en skarp skalpel. Placer membranen med cellerne opad på dråben af monteringsopløsningen på glasrutsjebanen. Tilsæt 10 mikroliter monteringsopløsning på toppen og midten af membranen, og placer en dæksel på toppen for at forsegle membranen mellem glasrutsjebanen og dækslet.
Tør objektglassene ved stuetemperatur i mørke i 24 timer. M celler detekteres ved overfladeudtryk af GP2 ved immunfluorescerende. Typisk, i et sammenløb monolayer, en til fem M celler er observeret i en given mikroskop felt ved 40X forstørrelse ved dag seks til otte post såning i prøver behandlet med RANKL og TNF alpha.
Der ses ingen GP2-udtryk i de ubehandlede prøver. Den ortogonale opfattelse af XZ flyet overlejret med en fallhalloidin sonde viser actin strukturer omkring hver celle, og GP2 udtryk på den apikale overflade af M-celler. Denne model opsummerer den lave frekvens af M-celler, der findes i den menneskelige tarm.
For at afgøre, om M-celler udviklet i denne model er i stand til at binde sig til IgA, er tilstedeværelsen af IgA på M-celler visualiseret ved hjælp af et fluorkonjugeret sekundært antistof, der genkender den tunge kæde af humant serum IgA. M celler behandlet med IgA i en time har IgA bundet til den apikale overflade, mens M celler i kontrol brønde, der kun blev behandlet med det sekundære antistof til IgA, har ingen påviseligt signal. Endvidere, IgA specifikt binder sig til den apikale overflade af M-celler, og er ikke fundet bundet til nogen celler mangler GP2 overflade plet.
Desuden har M-celler karakteristisk kortere tæt actin på deres apikale overflade. Skift til RANKL TNF alpha suppleret differentiering medier, når monolayers er omkring 80%sammenløb, er nøglen til at opnå god M celle differentiering. Denne teknik vil give forskerne mulighed for at udforske spørgsmål i forbindelse med M celle udvikling, samt vært patogen interaktioner og narkotika transport undersøgelser, der involverer M-celler.
Denne protokol beskriver, hvordan man inducerer differentieringen af M-celler i humane stamcelle-afledte ileal monolag og metoder til at vurdere deres udvikling.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved