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July 26th, 2019
DOI :
July 26th, 2019
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Title
0:27
Inducing M Cell Differentiation in Human Ileal Enteroid-derived Monolayers
5:46
Verifying M Cell Differentiation
9:30
Results: Immunofluorescence of M Cells in Human Ileal Enteroid-derived Monolayers
11:05
Conclusion
Transcript
आंत में एम कोशिकाओं की दुर्लभता के कारण आंतों में एम कोशिकाओं की दुर्लभता के कारण आंतों में होमोस्टेसिस और प्रतिरक्षा रक्षा में भूमिका की पूरी समझ की कमी है। मानव आंतों स्टेम सेल व्युत्पन्न संस्कृतियों में एम कोशिकाओं के प्रेरित भेदभाव एम सेल विकास और कार्यों के अध्ययन के लिए अनुमति देगा। ट्रांसवेल झिल्ली को कोट करने के लिए, ट्रांसवेल की वांछित संख्या को 24 अच्छी तरह से प्लेट में रखें, जिससे दो कक्ष प्रणाली बन सके।
एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स, या ईसीएम को पतला करें, ठंडे बाँझ फॉस्फेट बफर खारा में 25 गुना। फिर, झिल्ली पर प्रत्येक ऊपरी कक्ष में ठंडे पतला समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक ढक्कन के साथ 24 अच्छी तरह से थाली को कवर करें, और झिल्ली पर ईसीएम ठोसकरण की अनुमति देने के लिए दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
दो घंटे के बाद, इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें, और एक ऊतक संस्कृति हुड में रखें। बाँझ चिमटी का उपयोग करना, प्रत्येक ट्रांसवेल को धीरे से शेष समाधान को हटाने के लिए उलटा। झिल्ली को ढक्कन खुले के साथ हुड में सूखने दें जबकि कोशिकाओं को एकत्र किया जा रहा है।
इनक्यूबेटर से इलियल एंटरनोइड की प्लेट निकालें, और धीरे-धीरे वैक्यूम आकांक्षा या पिपेट के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया को हटा दें। ईसीएम को तोड़ने के लिए, ईसीएम में निलंबित ileal आंत्रप्रेन्योर्स युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से बर्फ ठंड 0.5 मिलीमोलर ईडीटीए के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक P1000 पिपेटर सेट के साथ तेजी से ऊपर और नीचे 500 माइक्रोलीटर को तोड़ने के लिए ईसीएम को तोड़ने के लिए, जिससे समाधान में ileal enteroids जारी।
प्रत्येक कुएं से 15 मिलीलीटर शंकु नलियों में समाधान एकत्र करें। 140G पर एक अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस गोली । गोली दिखाई दी जानी चाहिए, लेकिन आसानी से उखाड़ फेंका जा सकता है, इसलिए धीरे-धीरे वैक्यूम आकांक्षा या पिपेट के साथ सुपरनैट को हटा दें।
तंग जंक्शन लिंकेज को पचाने और एक कोशिकाओं में इलियल एंटरॉइड को तोड़ने के लिए, एकत्र किए गए हर पांच कुओं के अनुसार कमरे के तापमान ट्राइप्सिन के 500 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। एक P1000 पिपेटर का उपयोग करना, ऊपर और नीचे पाइपट को झुरमुटों को अलग करने के लिए। ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पानी में पांच मिनट या उससे कम समय के लिए इनक्यूबेट करें।
ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए ट्राइप्सिन के 500 माइक्रोलीटर 10% एफपीएस के साथ उन्नत डीएमईएम एफ-12 का एक मिलीलीटर जोड़ें। एक P1000 सेट के साथ ऊपर और नीचे ५०० माइक्रोलीटर पर कम से ५० बार शंकु नली के पक्ष के खिलाफ आगे शेष झुरमुट एकल कोशिकाओं में अलग करने के लिए । एक 50 मिलीलीटर शंकु नली पर एक 40 माइक्रोन सेल छन्नी रखें, और सेल छन्नी को गीला करने के लिए 10% एफपीएस के साथ उन्नत डीएमईएम एफ-12 का एक मिलीलीटर जोड़ें।
15 मिलीलीटर शंकु से छलनी पर एकल कोशिका निलंबन पिपेट करें। 10% एफपीएस के साथ उन्नत DMEM एफ-12 के एक मिलीलीटर के साथ छलनी धोएं। कोशिकाओं है कि एक नया 15 मिलीलीटर शंकु नली में 50 मिलीलीटर शंकु नली से कोशिका छलनी के माध्यम से चला गया स्थानांतरित करें।
हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 400G पर नए 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र । सेल पेलेट दिखाई देना चाहिए।
ध्यान से एक पिपेट के साथ सुपरनैट को हटा दें, फिर से पैलेट को बचाने के मामले में गोली उखाड़ दिया जाता है। 10 माइक्रोमॉलर Y27632 के साथ एमसीएमजीएफ प्लस में सेल पेलेट को रिस्पेंड करें। सुनिश्चित करें कि ईसीएम कोडित झिल्ली आंखों द्वारा मूल्यांकन के रूप में पूरी तरह से सूख गई है।
ऊपरी चैंबर को एमसीएमजीएफ प्लस के 200 माइक्रोलीटर से धोएं। फिर, प्रत्येक ऊपरी कक्ष में सेल समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रत्येक निचले कक्ष में 10 माइक्रोमोलर Y27632 के साथ MCMGF प्लस के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें।
5% CO2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में थाली रखें। विकास के एक दिन के बाद, ऊपरी कक्ष से मीडिया को हटा दें, और कई सेल परतों के विकास को रोकने के लिए ताजा MCMGF प्लस के २०० माइक्रोलीटर के साथ बदलें । एक बार मोनोलेयर लगभग 80% कॉन्फ्ल्यूंट होते हैं, आमतौर पर एक से तीन पोस्ट सीडिंग के दिनों के बीच, बेसिलेट्रल मीडिया को नियंत्रण कुओं के लिए भेदभाव मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करें, या एम सेल इंडक्शन कुओं के लिए एम सेल मीडिया के साथ।
ऊपरी कक्ष में मीडिया को दोनों स्थितियों के लिए भेदभाव मीडिया के साथ बदलें। क्यूआरटीपीसीआर द्वारा एम सेल भेदभाव को सत्यापित करने के लिए, पहले ऊपरी और नीचे कक्षों से मीडिया को हटा दें। कमरे के तापमान पीपीएस के 300 माइक्रोलीटर के साथ दो बार ऊपरी कक्ष को धीरे से धोएं।
प्रत्येक ऊपरी कक्ष में TRIzol के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इस बीच, प्रत्येक कुएं के लिए माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब लेबल करें, और प्रत्येक ट्यूब में 700 माइक्रोलीटर टीआरइज़ोल जोड़ें। एक P1000 के साथ तीन बार धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके सेल होमोजेनेट ले लीजिए, और सामग्री को इसी माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
मिश्रण करने के लिए पांच सेकंड के लिए भंवर। एक अतिरिक्त तीन मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों रखें, और फिर मानक QRTPCR प्रोटोकॉल के साथ जारी है, या नकारात्मक ८० डिग्री सेल्सियस पर नमूने की दुकान । इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एम सेल भेदभाव को सत्यापित करने के लिए, सबसे पहले, ऊपरी कक्ष से मीडिया को हटा दें।
कमरे के तापमान पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धीरे से धोएं। ऊपरी कक्ष में पीबीएस में कमरे के तापमान 4% पीएफए के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। पन्नी के साथ थाली को कवर करें और कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए खड़े होने दें।
पीएफए हटाने के बाद, कमरे के तापमान पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर के साथ ऊपरी कक्ष को तीन बार धोएं। समाधान को हटाने से पहले मोनोलेयर्स को ब्लॉक करने के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% बीएसए के 100 माइक्रोलीटर के साथ मोनोलेयर को इनक्यूबेट करें। पीबीएस में एक प्रतिशत बीएसए में जीपी2 प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान एक से 100 के कमजोर पड़ने पर तैयार करें, और प्रति अच्छी तरह से 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
समाधान हटाने से पहले, अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए दाग। ऊपरी कक्ष को कमरे के तापमान पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर के साथ तीन बार धोएं। फ्लोरोसेंटी टैग किए गए बकरी एंटी-माउस आईजीजी फॉलोइडिन और डीएपीआई का एक माध्यमिक दाग समाधान तैयार करें, और प्रति अच्छी तरह से 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए दाग। पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर से तीन बार कुओं को धोएं। फिर, एक ग्लास स्लाइड पर बढ़ते समाधान की एक पांच माइक्रोलीटर ड्रॉप रखें।
24 अच्छी तरह से थाली और उलटा से अच्छी तरह से हटा दें। ट्रांसवेल से झिल्ली को हटाने के दौरान, झिल्ली पूरी तरह से सपाट रहना चाहिए। झिल्ली में धक्कों ग्लास स्लाइड करने के लिए एक फर्म सील को रोकने के लिए, और बहुत छवि की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं ।
सफलता सुनिश्चित करने के लिए, एक तेज स्केलपेल का उपयोग करके झिल्ली को अच्छी तरह से काट लें। कांच स्लाइड पर बढ़ते समाधान की बूंद पर सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ झिल्ली प्लेस । झिल्ली के शीर्ष और केंद्र पर बढ़ते समाधान के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें, और ग्लास स्लाइड और कवर स्लिप के बीच झिल्ली को सील करने के लिए शीर्ष पर एक कवर स्लिप रखें।
24 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्लाइड सूखी। एम कोशिकाओं इम्यूनोफ्लोरेसेंट द्वारा GP2 की सतह अभिव्यक्ति द्वारा पता लगाया जाता है। आमतौर पर, एक कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर में, रैंकल और टीएनएफ अल्फा के साथ इलाज किए गए नमूनों में आठ पोस्ट सीडिंग के माध्यम से छह दिनों तक 40X आवर्धन में दिए गए माइक्रोस्कोप क्षेत्र में एक से पांच एम कोशिकाएं देखी जाती हैं।
अनुपचारित नमूनों में कोई GP2 अभिव्यक्ति नहीं देखी जाती है। एक फल्लोइडिन जांच के साथ मढ़ा XZ विमान के ऑर्थोगोनल दृश्य प्रत्येक कोशिका के आसपास actin संरचनाओं से पता चलता है, और एम कोशिकाओं की apical सतह पर GP2 अभिव्यक्ति । यह मॉडल मानव आंत में पाए जाने वाले एम कोशिकाओं की कम आवृत्ति को पुनः रीकैपिटल करता है।
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इस मॉडल में विकसित एम कोशिकाएं आईजीए से बांधने में सक्षम हैं, एम कोशिकाओं पर आईजीए की उपस्थिति को फ्लोर कंयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके कल्पना की जाती है जो मानव सीरम आईजीए की भारी श्रृंखला को पहचानता है। एम एक घंटे के लिए IgA के साथ इलाज कोशिकाओं IgA apical सतह के लिए बाध्य है, जबकि नियंत्रण कुओं में एम कोशिकाओं है कि केवल IgA के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इलाज किया गया, कोई पता लगाने योग्य संकेत है । इसके अलावा, आईजीए विशेष रूप से एम कोशिकाओं की एपिकल सतह से बांधता है, और जीपी 2 सतह दाग की कमी वाली किसी भी कोशिकाओं से बंधे नहीं पाया जाता है।
इसके अलावा, एम कोशिकाओं को उनकी एपिकल सतह पर विशेष रूप से कम घने ऐक्टिन होते हैं। रैंकल टीएनएफ अल्फा पूरक भेदभाव मीडिया पर स्विच करना जब मोनोलेयर लगभग 80% कॉन्फ्ल्यूंट होते हैं, तो अच्छे एम सेल भेदभाव को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस तकनीक से शोधकर्ताओं को एम सेल विकास से संबंधित सवालों का पता लगाने के साथ-साथ एम कोशिकाओं से जुड़े होस्ट रोगजनक इंटरैक्शन और ड्रग ट्रांसपोर्ट स्टडीज की भी अनुमति मिलेगी ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न ileal monolayers और उनके विकास का आकलन करने के लिए तरीकों में एम कोशिकाओं के भेदभाव प्रेरित करने के लिए.
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