대장 내M 세포의 희귀성으로 인해 M 세포가 장 내 항상성 및 면역 방어에서 재생하는 역할에 대한 완전한 이해가 부족합니다. 인간 장내 줄기세포 유래 배양에서 M 세포의 유도된 분화는 M 세포 발달 및 기능의 연구를 가능하게 할 것이다. 트랜스웰 멤브레인을 코팅하려면 원하는 수의 트랜스웰을 24개의 웰 플레이트에 배치하여 두 개의 챔버 시스템을 만듭니다.
세포외 매트릭스, 또는 ECM, 감기 멸균 인산염 완충식식염에 25 배 희석. 그런 다음 각 상부 챔버에 100 마이크로리터의 냉희석 용액을 멤브레인에 추가합니다. 뚜껑으로 24웰 플레이트를 덮고, 멤브레인에 ECM 응고를 허용하기 위해 2시간 동안 37°C의 조직 배양 배양에 플레이트를 배치한다.
2 시간 후, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 조직 배양 후드에 배치합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각 Transwell을 뒤집어 남은 용액을 부드럽게 제거하십시오. 세포가 수집되는 동안 뚜껑이 열려있는 후드에서 멤브레인이 건조하도록 하십시오.
인큐베이터에서 일막 장용의 플레이트를 제거하고 진공 포부 또는 파이펫으로 각 우물에서 배양 매체를 부드럽게 제거합니다. ECM을 분해하려면, 얼음 차가운 0.5 밀리머 EDTA의 500 마이크로 리터를 ECM에 매달린 일관 장수를 포함하는 각 우물에 추가하십시오. 파이펫은 500 마이크로리터로 설정된 P1000 파이프터를 사용하여 ECM을 분해하여 용액에 장막 엔터로이드를 방출합니다.
15 밀리리터 원판 튜브로 각 우물에서 솔루션을 수집합니다. 140G에서 원심분리기의 세포와 섭씨 4도에서 5분간 펠릿. 펠릿은 볼 수 있어야하지만 쉽게 빠질 수 있으므로 진공 포부 또는 파이펫으로 수퍼나탄을 천천히 제거하십시오.
단단한 접합 연결을 소화하고 일막 장수를 단일 세포로 분해하기 위해 수집 된 5 개의 우물당 실온 트립신 500 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. P1000 파이프터를 사용하여 파이펫을 위아래로 사용하여 덩어리를 분해합니다. 37도 의 수조에서 튜브를 5 분 이하로 배양하십시오.
트립신 500 마이크로리터당 10%의 FPS로 고급 DMEM F-12의 1밀리리터를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. P1000을 500 마이크로리터로 설정하여 피펫을 위아래로 500마이크로리터로 설정하여 원추형 튜브의 측면에 대해 50회 이상 설정하여 남은 덩어리를 단일 세포로 더 분해합니다. 50 밀리리터 원뿔관 위에 40 미크로넨 셀 스트레이너를 넣고, 10%FPS로 고급 DMEM F-12의 1밀리리터를 추가하여 세포 스트레이너를 습식합니다.
스트레이너에 15 밀리리터 원원식에서 단일 셀 서스펜션을 피펫. 10%FPS로 고급 DMEM F-12의 1밀리리터로 스트레이너를 세척합니다. 50 밀리리터 원판 튜브에서 세포 여과기를 통과한 세포를 새로운 15 밀리리터 원내 튜브로 옮킨다.
혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 400G에서 400G의 새로운 15 밀리리터 튜브의 세포를 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 표시해야 합니다.
조심스럽게 파이펫으로 상체를 제거하고 펠릿이 빠질 경우 다시 상체를 저장합니다. MCMGF 플러스에 세포 펠릿을 다시 일시 중단 10 마이크로 몰러 Y27632. ECM 코딩 멤브레인이 눈으로 평가된 대로 완전히 건조되었는지 확인합니다.
MCMGF 플러스의 200 마이크로 리터와 상부 챔버를 세척합니다. 그런 다음 각 상부 챔버에 200 마이크로리터의 셀 용액을 추가합니다. MCMGF의 700 마이크로리터와 각 하부 챔버에 10 마이크로몰러 Y27632를 추가합니다.
플레이트를 섭씨 37도의 조직 배양 배양인 인큐베이터에 5%CO2로 놓습니다. 성장의 하루 후, 상부 챔버에서 미디어를 제거하고, 여러 세포 층의 성장을 방지하기 위해 신선한 MCMGF 플러스의 200 마이크로 리터로 대체. 단층층이 약 80%의 컨서우루, 보통 1~3일 사이에, 기초매체를 제어 우물분화 매체로 바꾸거나 M 세포 유도 웰용 M 셀 미디어로 교체한다.
상부 챔버의 미디어를 두 조건에 대해 차별화 매체로 교체합니다. QRTPCR에 의한 M 셀 분화를 확인하려면 먼저 상부 및 하단 챔버에서 미디어를 제거합니다. 상온 PPS 300 마이크로리터로 상부 챔버를 두 번 부드럽게 씻으십시오.
각 상부 챔버에 300 마이크로리터의 TRIzol을 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 한편, 각 우물에 마이크로 원심 분리 튜브를 라벨, 각 튜브에 TRIzol의 700 마이크로 리터를 추가. P1000으로 세 번 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 균형화를 수집하고 해당 마이크로 원심 분리튜브로 내용을 전송합니다.
5초 동안 소용돌이가 섞입니다. 샘플을 3분 동안 실온에서 유지한 다음 표준 QRTPCR 프로토콜을 계속 사용하거나 음수 80도의 샘플을 저장합니다. 면역형광에 의한 M 세포 분화를 확인하기 위해 먼저 상부 챔버에서 미디어를 제거한다.
실온 PBS 300 마이크로리터로 2회 부드럽게 세척합니다. 상실에 실온 4%PFA 100 마이크로리터를 추가합니다. 호일로 접시를 덮고 실온에서 25 분 동안 방치하십시오.
PFA를 제거 한 후, 실온 PBS의 300 마이크로 리터와 함께 상부 챔버를 세 번 세척. 100 마이크로리터5%BSA를 PBS에 용해하여 실온에서 30분 동안 단층층을 배양하여 용액을 제거하기 전에 단층층을 차단합니다. 1~100의 희석시 PBS에서 1% BSA로 GP2 1차 항체 용액을 준비하고, 웰당 100마이크로리터를 추가한다.
용액을 제거하기 전에 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 얼룩. 상온 PBS 300 마이크로리터로 상실을 세 번 씻으시다. 형광 태그 염소 안티 마우스 IgG phalloidin 및 DAPI의 이차 얼룩 솔루션을 준비하고, 잘 당 100 마이크로 리터를 추가합니다.
어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 얼룩. PBS 300 마이크로리터로 우물을 세 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 유리 슬라이드에 장착 용액5 마이크로리터 드롭을 놓습니다.
24 웰 플레이트에서 우물을 제거하고 반전합니다. 트랜스웰에서 멤브레인을 제거하는 동안 멤브레인은 완전히 평평하게 유지되어야합니다. 멤브레인의 범프는 유리 슬라이드에 대한 단단한 밀봉을 방지하고 이미지 품질에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
성공을 보장하기 위해 날카로운 메스를 사용하여 우물에서 멤브레인을 조심스럽게 잘라냅니다. 유리 슬라이드에 장착 용액의 액적에 향하는 세포가 있는 멤브레인을 놓습니다. 멤브레인의 상단과 중앙에 10 마이크로리터의 장착 용액을 추가하고, 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이의 멤브레인을 밀봉하기 위해 상단에 덮개 슬립을 놓습니다.
24 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 슬라이드를 건조. M 세포는 면역 형광에 의해 GP2의 표면 발현에 의해 검출된다. 전형적으로, 컨물수 단일층에서, 1~5개의 M 세포는 RANKL 및 TNF 알파로 처리된 견본에서 6~8개의 포스트 시드에 의하여 40X 배율에서 주어진 현미경 필드에서 관찰됩니다.
처리되지 않은 샘플에서는 GP2 발현이 보이지 않습니다. Phalloidin 프로브와 오버레이된 XZ 평면의 직교뷰는 M 셀의 정압 표면에 각 셀을 둘러싼 액틴 구조 및 GP2 발현을 나타낸다. 이 모델은 인간 장에서 발견되는 M 세포의 저주파를 재구성합니다.
이 모델에서 개발된 M 세포가 IgA에 결합할 수 있는지 를 확인하기 위해, M 세포상에 IgA의 존재는 인간 혈청 IgA의 무거운 사슬을 인식하는 형광 접합이 이차 항체를 사용하여 시각화된다. IgA로 1시간 동안 치료된 M 세포는 IgA가 정약 표면에 묶여 있는 반면, 제어 우물의 M 세포는 IgA에 이차 항체로만 처리된 반면, 검출 가능한 신호가 없다. 또한, IgA는 M 세포의 정약 표면에 특별히 결합하고 GP2 표면 얼룩이 결여된 세포에 결합되어 있지 않다.
또한, M 세포는 그들의 정면에서 특징적으로 더 짧은 조밀한 액틴을 갖는다. 단층이 약 80%의 컨실루티드일 때 RANKL TNF 알파 보충 분화 매체로 전환하면 양호한 M 세포 분화를 달성하는 열쇠입니다. 이 기술은 연구원이 M 세포 발달과 관련있는 질문을 탐구하는 것을 허용할 것입니다, M 세포를 관련시키는 호스트 병원체 상호 작용 및 약 수송 연구 결과 뿐만 아니라.
