8.2K Views
•
11:34 min
•
July 26th, 2019
DOI :
July 26th, 2019
•0:04
Title
0:27
Inducing M Cell Differentiation in Human Ileal Enteroid-derived Monolayers
5:46
Verifying M Cell Differentiation
9:30
Results: Immunofluorescence of M Cells in Human Ileal Enteroid-derived Monolayers
11:05
Conclusion
Transcript
En full forståelse av hvilken rolle M-cellene spiller i intestinal homeostase og immunforsvar mangler, på grunn av sjeldenheten av M-celler i tarmen. Indusert differensiering av M-celler i human tarmstamcelleavledede kulturer vil tillate studiet av M-celleutvikling og funksjoner. For å belegge Transwell membraner, plasser ønsket antall Transwells i en 24 brønnplate, og lag et to kammersystem.
Fortynn den ekstracellulære matrisen, eller ECM, 25 ganger i kaldsteril fosfat bufret saltvann. Deretter legger du til 100 mikroliter kald fortynnet løsning i hvert øvre kammer på membranen. Dekk 24 brønnplaten med et lokk, og legg platen i en vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius i to timer for å tillate ECM-størkning på membranen.
Etter to timer, fjern platen fra inkubatoren, og legg i en vevskulturhette. Bruk sterile pinsett, inverter hver Transwell for å forsiktig fjerne gjenværende oppløsning. La membranene lufttørke i hetten med lokket åpent mens cellene samles inn.
Fjern platen av ileal enteroider fra inkubatoren, og fjern forsiktig kulturmediet fra hver brønn ved vakuumaspirasjon eller med en pipette. For å bryte opp ECM, tilsett 500 mikroliter iskalde 0,5 millimolar EDTA til hver brønn som inneholder ileal enteroider suspendert i ECM. Pipette opp og ned kraftig med en P1000 pipetter satt til 500 mikroliter for å bryte opp ECM, og dermed slippe ileal enteroider inn i løsningen.
Samle løsningen fra hver brønn i 15 milliliter koniske rør. Pellet cellene i en sentrifuge på 140G og fire grader Celsius i fem minutter. Pellet skal være synlig, men kan lett løsnes, så sakte fjerne supernatant ved vakuum aspirasjon eller med en pipette.
For å fordøye tette koblingskoblinger og bryte opp ileal enteroider i enkeltceller, resuspend pellet i 500 mikroliter romtemperatur trypsin per hver fem brønner samlet. Ved hjelp av en P1000 pipetter, pipette opp og ned for å disaggregate klumper. Inkuber rørene i et 37 graders Celsius vannbad i fem minutter eller mindre.
Legg til en milliliter avansert DMEM F-12 med 10% FPS per 500 mikroliter trypsin for å inaktivere trypsin. Pipette opp og ned med en P1000 satt til 500 mikroliter minst 50 ganger mot siden av konisk rør for å ytterligere desingregere gjenværende klumper i enkeltceller. Plasser en 40 mikron celle sil over en 50 milliliter konisk rør, og legg til en milliliter avansert DMEM F-12 med 10% FPS for å strupe cellesilen.
Pipette enkeltcellesuspensjonen fra 15 milliliter konisk på silen. Vask silen med en milliliter avansert DMEM F-12 med 10% FPS. Overfør cellene som gikk gjennom cellesilen fra det 50 milliliter koniske røret til et nytt konisk rør på 15 milliliter.
Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuger cellene i det nye 15 milliliter røret ved 400G i fem minutter ved romtemperatur. Cellepellet skal være synlig.
Fjern forsiktig supernatanten med en pipette, og lagrer igjen det overnaturlige i tilfelle pelleten løsnes. Resuspend cellen pellet i MCMGF pluss med 10 mikromolar Y27632. Sørg for at ECM-kodede membraner er fullstendig tørket som vurdert av øyet.
Vask det øvre kammeret med 200 mikroliter MCMGF pluss. Deretter legger du til 200 mikroliter celleløsning i hvert øvre kammer. Tilsett 700 mikroliter mcmgf pluss med 10 mikromos Y27632 til hvert nedre kammer.
Plasser platen i en 37 grader Celsius vevkultur inkubator med 5% CO2. Etter en dag med vekst, fjerne media fra det øvre kammeret, og erstatte med 200 mikroliter av friske MCMGF pluss for å hindre vekst av flere cellelag. Når monolayers er ca 80% samløpet, vanligvis mellom dag en til tre post seeding, erstatte basilaterale medier med differensiering media for kontrollbrønner, eller med M celle media for M celle induksjon brønner.
Bytt ut mediene i det øvre kammeret med differensieringsmedier for begge forholdene. Hvis du vil kontrollere M-celledilatering av QRTPCR, må du først fjerne mediet fra øvre og nederste kamre. Vask forsiktig det øvre kammeret to ganger med 300 mikroliter romtemperatur PPS.
Tilsett 300 mikroliter trizol i hvert øvre kammer, og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. I mellomtiden, etiketten mikro sentrifuge rør for hver brønn, og legge til 700 mikroliter trizol til hvert rør. Samle celle homogenat ved å forsiktig pipettering opp og ned tre ganger med en P1000, og overføre innholdet til tilsvarende mikro sentrifuge rør.
Vortex i fem sekunder å blande. Oppbevar prøvene ved romtemperatur i ytterligere tre minutter, og fortsett deretter med standard QRTPCR-protokoller, eller lagre prøver ved negative 80 grader Celsius. For å verifisere M cellediensjon ved immunofluorescence, først, fjern mediet fra det øvre kammeret.
Vask forsiktig to ganger med 300 mikroliter romtemperatur PBS. Legg til 100 mikroliter romtemperatur 4% PFA i PBS til det øvre kammeret. Dekk platen med folie og la stå i 25 minutter ved romtemperatur.
Etter å ha fjernet PFA, vask det øvre kammeret tre ganger med 300 mikroliter romtemperatur PBS. Inkuber monolayers med 100 mikroliter på 5% BSA oppløst i PBS i 30 minutter i mørket ved romtemperatur for å blokkere monolayers før du fjerner løsningen. Forbered GP2 primære antistoffløsning i én prosent BSA i PBS ved en fortynning på en til 100, og tilsett 100 mikroliter per brønn.
Beis i en time ved romtemperatur i mørket, før du fjerner løsningen. Vask det øvre kammeret tre ganger med 300 mikroliter romtemperatur PBS. Forbered en sekundær flekkløsning av fluorescerende merket geit anti-mus IgG falloidin og DAPI, og legg til 100 mikroliter per brønn.
Beis i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. Vask brønnene tre ganger med 300 mikroliter PBS. Deretter plasserer du en fem mikroliter dråpe monteringsløsning på et glasssklie.
Fjern brønnen fra 24-brønnplaten og inverter. Under fjerning av membranen fra Transwell må membranen forbli helt flat. Humper i membranen forhindrer en fast forsegling til glasslysbildet, og kan i stor grad påvirke bildekvaliteten.
For å sikre suksess, kutt forsiktig membranen fra brønnen ved hjelp av en skarp skalpell. Plasser membranen med cellene vendt opp på dråpe monteringsløsningen på glasslysbildet. Tilsett 10 mikroliter monteringsløsning på toppen og midten av membranen, og legg en dekselslip på toppen for å forsegle membranen mellom glasssklie og dekselslip.
Tørk lysbildene ved romtemperatur i mørket i 24 timer. M-celler oppdages ved overflateuttrykk av GP2 ved immunofluorescents. Vanligvis, i en samtidig monolayer, observeres en til fem M-celler i et gitt mikroskopfelt ved 40X forstørrelse av dag seks til åtte etter såing i prøver behandlet med RANKL og TNF alfa.
Ingen GP2-uttrykk er sett i de ubehandlede prøvene. Den ortogonale utsikten over XZ-flyet overlaid med en falloidinsonde viser actin strukturer rundt hver celle, og GP2 uttrykk på den adikiske overflaten av M-celler. Denne modellen rekapulerer den lave frekvensen av M-celler som finnes i tarmen.
For å avgjøre om M-cellene som er utviklet i denne modellen er i stand til å binde seg til IgA, visualiseres tilstedeværelsen av IgA på M-celler ved hjelp av et fluorkonjugert sekundært antistoff som gjenkjenner den tunge kjeden av humant serum IgA. M-celler behandlet med IgA i en time har IgA bundet til den a apiske overflaten, mens M-celler i kontrollbrønner som bare ble behandlet med det sekundære antistoffet til IgA, ikke har noe påvisbart signal. Videre binder IgA seg spesifikt til den akaliske overflaten av M-celler, og er ikke funnet bundet til noen celler som mangler GP2 overflateflekk.
I tillegg har M-celler karakteristisk kortere tett actin på deres akeiske overflate. Bytte til RANKL TNF alfa supplert differensiering media når monolayers er rundt 80% samløpet, er nøkkelen til å oppnå god M celle differensiering. Denne teknikken vil tillate forskere å utforske spørsmål knyttet til M celleutvikling, samt vert patogen interaksjoner og narkotika transport studier som involverer M-celler.
Denne protokollen beskriver hvordan å indusere differensiering av M celler i humant stilk cellen-avledet ileal monolagere og metoder for å vurdere deres utvikling.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved