Inducerad differentiering av M-Cellliknande celler i humana stamcells-härledda ileal Enteroid Monolayers

En fullständig förståelse för den roll M-cellerna spelar i intestinal homeostas och immunförsvar saknas, på grund av sällsynthet M celler i tarmen. Inducerad differentiering av M-celler i mänskliga intestinala stamceller härledda kulturer kommer att möjliggöra för studier av M cell utveckling och funktioner. För att belägga Transwell-membranen, placera önskat antal Transwells i en 24 brunnsplatta, vilket skapar ett två kammarsystem.

Späd den extracellulära matrisen, eller ECM, 25 gånger i kallsteril fosfatbuffrad koksaltlösning. Tillsätt sedan 100 mikroliter kallspädd lösning i varje övre kammare på membranet. Täck 24 brunnsplattan med lock och placera plattan i en inkubator för vävnadskultur vid 37 grader Celsius i två timmar för att tillåta ECM-stelningen på membranet.

Efter två timmar, ta bort plattan från inkubatorn, och placera i en vävnadskultur huva. Använd steril pincett, invertera varje Transwell för att försiktigt avlägsna återstående lösning. Låt membranen lufttorka i huven med locket öppet medan celler samlas in.

Ta bort plattan av ileal enteroids från inkubatorn, och försiktigt ta bort odlingsmedia från varje brunn genom vakuum aspiration eller med en pipett. För att bryta upp ECM, tillsätt 500 mikroliter iskall 0,5 millimolar EDTA till varje brunn som innehåller ileal enteroider upphängda i ECM. Pipett upp och ner kraftigt med en P1000 pipetter inställd på 500 mikroliter för att bryta upp ECM, och därigenom släppa ileal enteroider i lösningen.

Samla in lösningen från varje brunn i 15 milliliter koniska rör. Pellet cellerna i en centrifug vid 140G och fyra grader Celsius i fem minuter. Pelleten ska vara synlig, men kan lätt rubbas, så ta bort supernatanten genom vakuumaspiration eller med pipett.

För att smälta snäva knutpunkter och bryta upp ileal enteroids i enstaka celler, återanvända pelleten i 500 mikroliter av rumstemperatur trypsin per var femte brunnar samlas in. Med hjälp av en P1000 pipetter, pipeette upp och ner för att disaggregate klumparna. Inkubera rören i en 37 grader Celsius vattenbad i fem minuter eller mindre.

Lägg till en milliliter avancerade DMEM F-12 med 10%FPS per 500 mikroliter trypsin för att inaktivera trypsin. Pipett uppåt och nedåt med en P1000 inställd på 500 mikroliter minst 50 gånger mot sidan av det koniska röret för att ytterligare disaggregera återstående klumpar i enstaka celler. Placera en 40 mikron cell sil över en 50 milliliter koniska rör, och tillsätt en milliliter av avancerade DMEM F-12 med 10%FPS att väta cellen sil.

Pipettera encellsupphängningen från de 15 milliliter koniska på silen. Tvätta silen med en milliliter av avancerad DMEM F-12 med 10%FPS. Överför cellerna som gick igenom cellsilen från det 50 milliliter koniska röret till ett nytt koniskt rör på 15 milliliter.

Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera cellerna i det nya 15 milliliterröret vid 400G i fem minuter vid rumstemperatur. Cellpelleten ska vara synlig.

Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett, återigen spara supernatanten ifall pelleten skulle rubbas. Resuspend cell pelleten i MCMGF plus med 10 mikromolar Y27632. Se till att de ECM-kodade membranen har torkat helt enligt bedömning med ögat.

Tvätta den övre kammaren med 200 mikroliter av MCMGF plus. Lägg sedan till 200 mikroliter av celllösning i varje övre kammare. Lägg till 700 mikroliter av MCMGF plus med 10 mikromolar Y27632 till varje nedre kammare.

Placera plattan i en 37 grader Celsius vävnad kultur inkubator med 5%CO2. Efter en dag av tillväxt, ta bort media från den övre kammaren, och ersätta med 200 mikroliter av färska MCMGF plus att förhindra tillväxt av flera cell lager. När monolayers är ungefär 80%konfluenta, vanligtvis mellan dag ett till tre post seeding, ersätta basilateral media med differentiering media för kontroll brunnar, eller med M cell media för M cell induktion brunnar.

Byt ut media i den övre kammaren med differentieringsmedia för båda förhållandena. Verifiera M-celldifferentiering genom QRTPCR genom att först ta bort mediet från övre och nedre kammare. Tvätta försiktigt den övre kammaren två gånger med 300 mikroliter av rumstemperatur PPS.

Tillsätt 300 mikroliter av TRIzol till varje övre kammare, och inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Under tiden, etikett mikro centrifugrör för varje brunn, och lägga till 700 mikroliter av TRIzol till varje rör. Samla cellhomogenat genom att försiktigt pipettera upp och ner tre gånger med en P1000, och överför innehållet till motsvarande mikrocentrifugrör.

Vortex i fem sekunder för att blanda. Förvara proverna i rumstemperatur i ytterligare tre minuter, och fortsätt sedan med standard QRTPCR-protokoll, eller lagra prover vid negativa 80 grader Celsius. För att verifiera M cell differentiering genom immunofluorescens, först, ta bort media från den övre kammaren.

Tvätta varsamt två gånger med 300 mikroliter av rumstemperatur PBS. Tillsätt 100 mikroliter av rumstemperatur 4%PFA i PBS till den övre kammaren. Täck plattan med folie och låt stå i 25 minuter vid rumstemperatur.

Efter att du har tagit bort PFA, tvätta den övre kammaren tre gånger med 300 mikroliter av rumstemperatur PBS. Inkubera monolayersna med 100 mikroliter av 5%BSA upplöst i PBS i 30 minuter i mörker vid rumstemperatur för att blockera monolayersna innan lösningen tas bort. Förbered GP2 primär antikroppslösning i en procent BSA i PBS vid en spädning av en till 100, och tillsätt 100 mikroliter per brunn.

Fläck i en timme i rumstemperatur i mörker, innan lösningen tas bort. Tvätta den övre kammaren tre gånger med 300 mikroliter av rumstemperatur PBS. Förbered en sekundär fläck lösning av fluorescently taggade get anti-mus IgG phalloidin och DAPI, och lägga till 100 mikroliter per brunn.

Fläck i 30 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Tvätta brunnarna tre gånger med 300 mikroliter PBS. Placera sedan en fem mikroliter droppe monteringslösning på en glasrutschkana.

Ta bort brunnen från 24 brunnsplattan och invertera. Under avlägsnande av membranet från Transwell måste membranet förbli helt platt. Stötar i membranet förhindrar en fast tätning till glasglaset, och kan i hög grad påverka bildkvaliteten.

För att säkerställa framgång, skär försiktigt membranet från brunnen med hjälp av en skarp skalpell. Placera membranet med cellerna vända uppåt på droppen av monteringslösning på glasglaset. Lägg till 10 mikroliter av monteringslösning på toppen och mitten av membranet, och placera en täckglidning ovanpå för att täta membranet mellan glasrutschkanan och täckglidningen.

Torka rutschkanorna i rumstemperatur i mörker i 24 timmar. M-celler detekteras genom ytuttryck av GP2 av immunofluorescents. Typiskt, i en confluent monolayer, en till fem M-celler observeras i ett visst mikroskop fält vid 40X förstoring av dagar sex till åtta post seeding i prover som behandlats med RANKL och TNF alfa.

Inget GP2-uttryck ses i de obehandlade proverna. Den ortogonala syn på XZ planet överlagrad med en phalloidin sond visar aktin strukturer som omger varje cell, och GP2 uttryck på den apikala ytan av M celler. Denna modell rekapitulerar den låga frekvensen av M-celler som finns i den mänskliga tarmen.

För att avgöra om M-cellerna som utvecklats i denna modell kan binda till IgA, är förekomsten av IgA på M-celler visualiseras med hjälp av en fluor konjugerad sekundär antikropp som känner igen den tunga kedjan av humant serum IgA. M-celler som behandlats med IgA i en timme har IgA bundet till den apikala ytan, medan M-celler i kontroll brunnar som endast behandlades med den sekundära antikroppen mot IgA, har ingen detekterbar signal. Vidare, IgA specifikt binder till den apikala ytan av M-celler, och finns inte bunden till några celler som saknar GP2 yta fläck.

Dessutom har M-celler karakteristiskt kortare tät aktin på deras apikala yta. Byta till RANKL TNF alfa kompletteras differentiering media när monolayers är runt 80%konfluent, är nyckeln till att uppnå god M cell differentiering. Denna teknik kommer att göra det möjligt för forskare att utforska frågor som rör M cell utveckling, samt värd patogeninteraktioner och läkemedelstransport studier med M-celler.