Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

这项研究的部分资金来自巴西的正是《财务法典》 001号, 由巴西的卫报公司资助。CAPES 为 a. f. Marciano 提供博士奖学金。我们感谢巴西国家科学和技术发展委员会为 J. Fiorotti 提供博士奖学金。这项研究还得到了 Carlos Chagas Filho 里约热内卢州研究基金会 (FAPERJ) 和 CNPq. v. r. e. p. Bittencourt 研究员的赠款的支持。

本研究中使用的滴答声来自里约热内卢联邦农村大学的一个人工群体, 这些方法已得到使用脊椎动物伦理委员会 (CEUA-IV任何 #037) 的批准。
1. 被打勾的女性
<ol><li>在滴度收集后, 用自来水清洗被吞没的雌性, 并将它们浸泡在 0.5% (v/v) 次氯酸钠溶液中 3分钟, 在500毫升玻璃烧杯接受者中保持 3分钟, 以保持角质层卫生 (图 1), 然后用无菌纸巾将所有雌性水浸泡 (...

<ol>
	<li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil.">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterin&#225;ria. 23 (2), 150-156 (2014).</li><li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins.">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li><li>Camargo, M. 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当这项研究旨在研究微生物在实验节肢动物模型中的体内作用时, 病原体的接种是有用的, 因为它确保病原体在宿主体内。该技术也可用于接种 RNA 干扰 (RNAi) 等分子。在阴囊和头状花序之间的接种被认为更容易执行, 但经常损害吉内的器官, 损害鸡蛋的生存能力 12,13。Gené的器官在解剖上靠近头盖骨的前部, 它是病毒14的重要器官.因此, ?...

牛是一种对热带地区牲畜有巨大负面影响的对牲畜产生了巨大的负面影响。这种滴答药是病原体的载体, 如巴贝西亚牛、巴贝西亚大代米纳和阿纳苏拉西翁, 再加上直接的血液喂养损伤, 可以减少牛奶和肉类的生产, 导致贫血, 并最终导致死亡。据估计, 这种外生寄生虫每年造成的损失为32.4亿美元.需要可持续的方法, 昆虫病原剂的使用被认为是减少使用化学杀菌剂2,3,4的一个有希望的替代品。
昆虫病原真菌, 如巨细胞病, 是节肢动物的天敌, 包括滴虫, 一些分离物可用作生物控制器。这些病原体通过角质层主动感染宿主, 并对它们的身体进行2,5,6的殖民。随着感染的发展, 细胞和体液反应是由滴虫免疫系统介导的。据报道, 在对病原体 7,8 具有挑战性的情况下, 对滴虫血淋巴的分析是评估免疫反应的有用工具.
关节的免疫反应分为体液和细胞反应。体液反应涉及血凝过程和抗菌蛋白肽的产生, 而细胞免疫反应是通过血细胞进行的。这些细胞存在于所有节肢动物的血淋巴中, 据报道, 它们在涉及先天免疫反应的研究中发展出表达作用, 因为它与吞噬和包封过程直接相关。因此, 对血细胞的研究有助于研究死亡途径和了解自体吞噬、凋亡和坏死等过程。在一些无脊椎动物作为双壳体, 血细胞的收集面临的限制, 如细胞破坏, 低血淋巴体积获得, 低浓度的恢复细胞10.根据所采用的方法, 通常会降低细胞浓度, 直接影响细胞的定量和分析。
血淋巴中循环的血细胞数量在不同节肢动物之间是可变的, 由于性别、年龄和节肢动物发育阶段11等生理阶段不同, 同一物种的血细胞数量可能发生变化。血细胞也可以被发现粘附在一些器官上, 并在感染过程1 1 后立即释放到循环中。然而, 大多数研究报告使用昆虫, 而滴答声仍然较少探索有关他们的生理和病理。尽管病原体接种和血淋巴收集在滴答声是较少使用的技术, 建立标准的方法有助于发展更准确的研究。
本研究的目的是比较最常用的血淋巴收集方法, 并将病原体接种成r. 微 + 滴答声, 评价血淋巴采集和血细胞浓度的有效性。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

滴答声是强制的血食性外寄生虫和犀牛微加子在兽医学中具有重要意义, 因为它导致贫血, 体重减轻, 动物的皮革贬值, 也可以作为几种病原体的载体。由于控制这些寄生虫的费用过高, 不当使用化学杀菌剂对环境造成损害, 以及对传统寄生虫的抵抗力增加, 对滴答声的替代控制, 使用昆虫病原真菌, 例如, 已被认为是一个有趣的方法。然而, 很少有研究表明, 滴答声的免疫系统是如何对抗这些致癌物质的。因此, 该协议演示了两种用于昆虫病原体接种充血的女性和两种技术用于血淋巴收集和血细胞采集。在腿部插入的病原体接种在雌性的身体允许评估女性的生物参数, 不像在阴囊和头状花序之间的接种, 这经常损害 Gené的器官。多侧血淋巴收集产生了更高的体积恢复比收集通过腿。滴虫血淋巴收集和处理的一些局限性包括: (i) 血细胞破坏率高; (二) 血淋巴污染与中肠紊乱; (三) 低血淋巴体积恢复。当血淋巴通过腿部切割收集时, 血淋巴在腿部开口处积累需要时间, 有利于凝血过程。此外, 与背侧收集相比, 通过腿部收集的血细胞较少, 尽管第一种方法被认为更容易实施。了解昆虫病原剂介导的滴答声中的免疫反应有助于揭示其发病机制, 并为滴答声控制制定新的目标。这里描述的接种过程需要非常低的技术资源, 不仅可以用来暴露在病原微生物面前的滴答声。同样, 血淋巴的收集可能是许多生理研究的第一步。

本文探讨了接种和血淋巴收集方法应用于滴答声。在大腿和女性身体之间接种后, 在此过程中可以分泌一些液体 (血淋巴);但是, 需要注意的是, 当接种完成后, 针尖或接种部位不存在液体或组织, 以确保真菌悬浮液被完全接种。当接种过程正确进行时, 针头插入不会导致滴虫雌性死亡。另一方面, 滴答声在接种昆虫病原真菌约48小时后死亡。大腿与滴虫女性身体之间的接种会?...

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Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

对滴虫血淋巴的分析是一个重要的信息来源, 说明一些病原体是如何引起疾病的, 以及滴答声对这种感染的免疫反应。本研究旨在说明如何接种真菌繁殖和从根茎微加高的雌性中采集血淋巴。

在无脊椎动物病理学研究中发现血淋巴收集和接种转移到大黄微加分中

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

虱子是造血的异位，红头孢菌微加，俗称牛虱对热带地区的牲畜有巨大的负面经济影响。此外，人们越来越担心环境条件恶化，以及因不当使用化学杀菌剂和虱子种群对传统寄生虫的抵抗力增加而引起的公共卫生忧虑，这刺激了对替代控制方法的研究，例如使用致病致病真菌。这些内托帕根通过它们的角质层积极感染节肢动物宿主，并殖民他们的身体。节肢动物对真菌感染可能有不同的反应。节肢动物免疫系统分为体液反应和细胞反应。体液反应涉及血凝过程和抗菌分子的产生，而血细胞调解细胞免疫反应。大多数关于节肢动物免疫反应的研究都报告使用昆虫，而滴答声反应仍然较少被探索。此外，病原体接种和滴答声血淋巴收集是更好的广泛技术，必须更好地了解节肢动物的免疫反应。因此，此视频地址技术-用于拍摄接种，血淋巴收集和处理。由于滴答声血细胞收获面临一些限制，如细胞中断，低血淋巴值获得，和低浓度的恢复细胞。直接感染细胞配置和分析。滴答声收集后，洗涤女性。使用自来水，在 500 毫升玻璃杯接收器中浸入 0.5% 次氯酸钠溶液中三分钟。在角质层卫生方面，将女性分为同质组，每组为20名女性。执行每个组的三个复制。在接种过程中使用了代谢罗伯茨气孔。在塑料石蜡膜表面加入五微升的液体，将高毛孔悬浮液悬浮在一起。为了加快接种过程，塑料石蜡膜表面可以添加多个气泡，每个气泡对应五微升。使用一毫米超细胰岛素注射器和0.3毫米针头将悬浮液并接种到滴答声中。在使用注射器之前，请记住从注射器中带走所有的空气。接种5微升真菌悬浮到滴答声和风度之间的虱子雌性。针切口后，框架上可能存在少量血lymph。注意不要给空气接种。使用一毫升超细胰岛素注射器与 0.3 毫米针头耦合，用腿部大腿和女性身体之间的真菌悬浮液给女性接种。当在腿部大腿和滴答女性的身体之间进行骨质接种时，插入针头后大腿上可能会出现少量血淋巴。注意不要给空气接种。使用有翼输液的橡胶部分设置 0.3 米机毛细管和滤清器尖端执行血氧收集。使用 0.3 毫米针破坏女性后皮。中断后，对滴答声身体的动脉部分施加温和的压力。观察从中断站点中汇集的几乎透明的液体。通过吸油液通过过滤尖端吸吮液体来收集血氧，并结合到有翼输液装置的橡胶部分和 0.3 毫米毛细管。在卡子的固定过程中，不要按压滴答声，因为这可能破坏中滴，污染血度。等待，直到温和的压力可以排出液体没有污染。固定滴答声。剪一条前腿。一条或多条腿可以剪，同一条腿也可以剪一次。对滴答声的后体部分施加温和的压力。观察切割侧的透明液体气泡，然后用毛细管收集。在调动过程中，不要按滴答声的身体，因为这可能破坏中滴和污染血红素。等待，直到温和的压力可以排出液体没有污染。在血与升收集后，将它存入 1.5 mililits 微管中，以前填充了 30 微升蛋白酶鸡尾酒和 82 微升盐水缓冲液。在整个血与中收集过程中，将微管放在冰上。离心样品和血细胞的软颗粒将在血淋巴离心后形成。对于血与素定量，通过计算微管内的总量并贴现蛋白酶鸡尾酒和盐水缓冲液的体积来量化获得的血与量。小心地取出上一级无细胞血压，轻轻重新悬浮细胞。通过在纽鲍尔腔中放置10微升再悬浮的血细胞来量化血细胞。对于重新悬浮的细胞，使用了培养媒体。切割滴答声的前腿，对滴答声的后体部分施加温和的压力，观察切割部位上出现透明的液体气泡。直接在干净的显微镜幻灯片上涂抹血降滴。之后，使用适当的方法来染色细胞。腿部大腿和滴答声女性身体之间的接种也可以损害滴答声内脏器官，如中角和麦芽管。当滴答声中，在后血松集合的针头中断时，获得的液体是红色的，不是透明的。这表示血与福收集不正确。在这种情况下，血红蛋白应被丢弃，因为它被污染。当虱子自然感染高负载的病原体时，或在接种病原体导致的死亡过程后的最后步骤中，也可以观察到血与活的污染。在后体收集后获得的血与量大于通过腿部收集获得的体积。尽管污染的易用性在第一个收集方法中较高。血细胞浓度在后细胞集合中也显著增加。当正确的血细胞收集进行良好的涂片可以获得一个很好的涂片，有可能区分不同的血细胞染色后。本视频提供了有关将病原体（特别是致病真菌）接种到虱子中并收集其血淋巴素的方法的信息。这里提出的技术需要非常低的技术资源在我们的经典步骤研究滴答声生理学，滴答声病理学和滴答声的免疫反应。正确收获节肢动物细胞和无细胞血质作用，对于为后续研究提供可靠的信息至关重要。因此，了解在执行这些技术时观察到的最常见错误也很重要。此外，本研究的建议应确定通过变形或切割腿部收集血肢的更合适的地点，同时考虑获得的体积和污染概率的差异。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

RNA干扰在蜱

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

科研

免疫与感染

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

一个钙生物发光检测蚊虫的功能分析（埃及伊蚊）和刻度（镰形扇头microplus）G蛋白偶联受体

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Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

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Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

唾液，唾液腺，淋巴收集肩突硬蜱蜱

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

定向分化诱导性多潜能干细胞向T淋巴细胞

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

蜱对动物饲养的传输和Xenodiagnosis在莱姆病研究

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

该<em&gt;离体</em&gt;结肠器官培养及使用抗菌宿主防御研究

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

费希尔344大鼠气管内接种土 tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

中性粒细胞衍生微粒的分离与鉴定功能研究

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

大动物淋巴结的采集与处理 RNA 分析: 大动物 Transcriptomic 淋巴结的制备研究

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...