Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Denne undersøgelse blev delvis finansieret af Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) fra Brasilien, Finance Code 001. CAPES leverede Ph.D. stipendium til A.F. Marciano. Vi takker det nationale råd for videnskabelig og teknologisk udvikling (CNPq) i Brasilien for at levere Ph.D. stipendium til J. Fiorotti. Denne forskning blev også støttet af tilskud fra Carlos Chagas Filho Foundation for Research i staten Rio de Janeiro (FAPERJ) og CNPq. V.R.E.P. Bittencourt er en CNPq forsker.

Flåter, der anvendes i denne undersøgelse, er fremstillet af en kunstig koloni, der er blevet anvendt ved Federal Rural University of Rio de Janeiro, og som er blevet godkendt af Udvalget for etik vedrørende brug af hvirveldyr (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Afkryds de engorged hunner
<ol><li>Efter flåt indsamling, vask engorged hunner ved hjælp af vand fra hanen og fordybe dem i 0,5% (v/v) natriumhypochlorit opløsning i 3 min i en 500 mL bægerglas recipient, for neglebånd hygiejne (<s...

<ol>
	<li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil.">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterin&#225;ria. 23 (2), 150-156 (2014).</li><li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins.">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li><li>Camargo, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+for+controlling+Rhipicephalus+microplus+ticks+under+field+conditions.">Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions.</a> Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).</li><li>Perinotto, W. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pathogenicity+of+different+Metarhizium+anisopliae+s.l.+isolates+in+oil+formulations+against+Rhipicephalus+microplus.">In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus.</a> Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).</li><li>Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+insect+epicuticle+degradation+by+entomopathogenic+fungi.">Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).</li><li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+on+the+surface:+Entomopathogenic+fungi+versus+the+insect+cuticle.">Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle.</a> Insects. 4 (3), 357-374 (2013).</li><li>Angelo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+serpins+involved+in+cellular+immune+response+of+Rhipicephalus+microplus+challenged+with+fungi.">Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi.</a> Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).</li><li>De Paulo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhipicephalus+microplus+infected+by+Metarhizium:+unveiling+hemocyte+quantification,+GFP-fungi+virulence,+and+ovary+infection.">Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection.</a> Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).</li><li>Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+and+signalling+in+insect+haemocyte+immunity.">Regulators and signalling in insect haemocyte immunity.</a> Cell Signal. 21, 186-195 (2009).</li><li>Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gon&#231;alves, J., Machado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiaggregant+and+toxic+properties+of+different+solutions+on+hemocytes+of+three+freshwater+bivalves.">Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves.</a> Toxicological &amp; Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).</li><li>Gene, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;moires+de+l'Acad&#233;mie+royale+des+sciences.">M&#233;moires de l'Acad&#233;mie royale des sciences.</a> Torino. 9, 751 (1848).</li><li>Lees, A. D., Beament, J. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+waxing+in+ticks.">An organ waxing in ticks.</a> The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).</li><li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of ticks. , (2014).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemocytes+proliferation+in+larval+silkworm+Bombyx+mori.">Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).</li><li>Bowden, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humoral+immune+systems+of+the+American+lobster+(Homarus+americanus)+and+the+European+lobster+(Homarus+gammarus).">The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus).</a> Fish Research. 186, 367-371 (2017).</li><li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks.">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li><li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immunity+and+its+signaling:+an+overview.">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li><li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks.">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li><li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks.">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).</li><li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva,+salivary+gland,+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks.">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).</li></ol>

Inokulation af patogener er nyttigt, når undersøgelsen har til formål at undersøge in vivo-virkningen af mikroorganismer i eksperimentelle leddyr modeller, fordi det forsikrer, at patogenet er inde i værten. Teknikken kan også anvendes til inokulate molekyler såsom RNA interferens (RNAi). Inokulation mellem scutum og kapitulum anses for lettere at udføre, men ofte skader genés orgel, hvilket forringer æggenes levedygtighed12,13. Genés orgel er anatomis...

Kvæg flåt, Rhipicephalus microplus, er en hæmatophagus Ectoparasite med en enorm negativ indvirkning på husdyr i tropiske områder. Dette kryds er vektor af patogene agenser såsom babesia bovis, babesia bigemina, og anaplasma marginale , at kombineret med den direkte hemofeeding skader, kan reducere mælk og kødproduktion, forårsage anæmi og i sidste ende døden. Tab forårsaget af denne Ectoparasite blev anslået i 3.240.000.000 dollars om året i Brasilien1. Bæredygtige metoder er påkrævet, og brugen af entomopathogenic agenter betragtes som et lovende alternativ til at reducere brugen af kemiske acaricider2,3,4.
Entomopatogene svampe, såsom Metarhizium spp., er naturlige fjender af leddyr, herunder flåter, og nogle isolater kan bruges som biocontrollere. Disse patogener inficere aktivt værten gennem neglebånd og kolonisere deres krop2,5,6. Som infektionen udvikler, cellulære og humorale reaktioner medieres af flåt immunsystemet. Analyse af kryds hemolymph er rapporteret som et nyttigt redskab til at vurdere immunrespons efter den udfordrende med patogener7,8.
Arthropods ' immunrespons er opdelt i humorale og cellulære reaktioner. Den humorale respons involverer hæmagglutination processer og produktion af antimikrobielle proteiner/peptider, mens den cellulære immunrespons udføres gennem hemocytes. Disse celler er til stede i hæmolymph fra alle leddyr og er rapporteret til at udvikle en udtryksfulde rolle i undersøgelser, der involverer medfødt immunrespons9, da det er direkte relateret til fagocytose og indkapsling processer. Derfor undersøgelser om hemocytes kan bidrage til at undersøge død pathway og forstå processer såsom autophagy, apoptose, og nekrose. I nogle invertebrater som biventiler, den hemocytes ' samling ansigter begrænsninger som celleforstyrrelse, lav hæmolymph volumen opnået, og lav koncentration af gendannede celler10. Meget hyppigt, afhængigt af den anvendte metode, er reduceret koncentration af celler opnået, påvirker direkte på celler kvantificering og analyse.
Antallet af hemocytter cirkulerer i hæmolymph er variabel blandt forskellige leddyr og det kan ændre sig i de samme arter på grund af forskellige fysiologiske stadier såsom køn, alder, og leddyr er udviklingsmæssige fase11. Hemocytter kan også findes overholdt nogle organer og blive frigivet i omløb lige efter infektionen proces11. Ikke desto mindre, de fleste undersøgelser rapporterede bruge insekter, mens flåter forbliver mindre udforsket med hensyn til deres fysiologi og patologi. Trods patogen inokulation og hæmolymph indsamling i flåter er mindre anvendte teknikker, etablering af standardmetoder hjælper udviklingen af mere præcise undersøgelser.
Formålet med denne undersøgelse var at sammenligne de mest anvendte metoder til hæmolymph indsamling og inokulering af patogener i R. microplus flåter, evaluere effekten i hæmolymph erhvervelse og hemocytes koncentration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

Flåter er forpligte hæmatophagøse ektoparasitter og rhipicephalus microplus har stor betydning i veterinærmedicin, fordi det forårsager anæmi, vægttab, afskrivning af dyrenes læder og også kan fungere som en vektor af flere patogener. På grund af de enorme omkostninger til at kontrollere disse parasitter, skader på miljøet forårsaget af uhensigtsmæssig brug af kemiske acaricider, og den øgede resistens over for traditionelle parasiticider, alternativ kontrol af flåter, ved hjælp af entomopatogene svampe, for eksempel, er blevet betragtet som en interessant tilgang. Ikke desto mindre har kun få undersøgelser vist, hvordan Tick immunsystem virker til at bekæmpe disse entomopathogens. Derfor, denne protokol viser to metoder, der anvendes til entomopatiogen inokulering i engorged kvinder og to teknikker, der anvendes til hæmolymph indsamling og hemocytes høst. Inokulation af patogener på benet indsættelse i kryds hundens krop tillader evaluering af hunner biologiske parametre i modsætning til inokulation mellem scutum og kapitulum, som ofte skader Genés orgel. Dorsal hæmolymph samling gav en højere volumen opsving end indsamling gennem benene. Nogle begrænsninger af flåt hæmolymph indsamling og behandling omfatter i) høje rater af hemocytes ' afbrydelse, II) hæmolymph forurening med forstyrret midgut, og III) lav hæmolymph volumen opsving. Når hæmolymph er indsamlet gennem benet skæring, hæmolymph tager tid at akkumulere på benet åbning, favoriserer koagulations processen. Desuden opnås færre hemocytter i samlingen gennem benet i forhold til rygsamlingen, selvom den første metode anses for lettere at blive udført. Forståelse af immunrespons i flåter medieret af entomopathogenic agenter hjælper med at afsløre deres patogenese og udvikle nye mål for flåt kontrol. De her beskrevne inokulations processer kræver meget lave teknologiske ressourcer og kan ikke kun anvendes til at afsløre flåter til patogene mikroorganismer. Tilsvarende, indsamlingen af flåt hæmolymph kan repræsentere det første skridt for mange fysiologiske undersøgelser.

Denne artikel nærmer inokulering og hæmolymph indsamlingsmetoder anvendes til flåter. Efter inokulationen mellem benet lår og kryds hundens krop, nogle væske (hæmolymph) kan udskilles under processen; Det er dog vigtigt at bemærke, at når inokulationen er færdig, var der ingen væske eller væv i nålens spids eller på inokulationsstedet, hvilket sikrede, at svampe suspensionen blev fuldstændig inokuleret. Når inokulations processen blev udført korrekt, var nåle indsættelse...

Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analyse af Tick hemolymph repræsenterer en vigtig kilde til information om, hvordan nogle patogener forårsage sygdom og hvordan flåter immunologisk reagere på denne infektion. Nærværende undersøgelse viser, hvordan man inokulere svampe spredningslegemer og indsamle hæmolymph fra rhipicephalus microplus engorged kvinder.

Videregivelse af hemolymph indsamling og inokulation af Metarhizium blastosporer til Rhipicephalus Microplus flåter mod Invertebrat patologiske studier

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Flåter er hæmatophagous ektoparasitter, Rhipicephalus microplus, populært kendt som kvæg kryds har enorme negative økonomiske konsekvenser for husdyr i tropiske områder. Desuden stimulerer stigende bekymring over nedbrydede miljøforhold og folkesundhedsproblemer forårsaget af uhensigtsmæssig brug af kemiske acarider og stigende modstandsdygtighed over for traditionelle parasitter forskning i alternative kontrolmetoder, såsom anvendelse af entomopathogenic svampe. Disse entomopathogens aktivt inficere leddyr værter, gennem deres neglebånd og kolonisere deres krop.Leddyret kan have forskellige reaktioner på svampeinfektionen. Leddyr immunsystem er opdelt i humoral og cellulære reaktioner. Den humoristiske reaktion indebærer hemagglutination proces og produktion af antimikrobielle molekyler, mens hæmocytter mægle den cellulære immunrespons.De fleste undersøgelser af leddyr immunrespons er rapporteret ved hjælp af insekter, mens kryds reaktioner forbliver mindre udforsket. Også, patogen inokulering og kryds hæmolymfe indsamling er dårligt udbredte teknikker er nødvendige for bedre at forstå leddyr immunrespons. Derfor er denne video adresse teknikker \ bruges til at filme vaccination, hæmolymfe indsamling og behandling.Da kryds hemocytter høst står over for nogle begrænsninger, såsom celler forstyrrelser, lav hæmolymfe værdi opnå, og lav koncentration af genvundne celler. Direkte inficerer på celler konfiguration og analyse. Efter kryds indsamling, vask engorged hunner.Brug vand fra hanen og nedsænkes i 0,5% natriumhypochloritopløsning i tre minutter i en 500 milliliter glasbæger modtager. For neglebåndshygiejne opdeles hunnerne i homogene grupper med 20 hunner hver. Der blev udført tre replikater af hver gruppe.Metarhizium robertsii blastosporer blev anvendt i inokuleringsprocessen. Tilføj på en væske af fem mikroliter metarhizium blastospores suspension til overfladen af en plast paraffin film. For at fremskynde vaccinationsprocessen kan der tilsættes flere bobler til plastparaffinfilmoverfladen, hver boble, der svarer til fem mikroliter.Brug en ultrafin insulinsprøjte på en millimeter ultrafin insulin og en 0,3 millimeter nål til at sætte en suspension og inokulere den i flåten. Husk at tage al luften ud af sprøjten, før du bruger den. Inokuler 5 mikroliter af svamp suspension i kryds kvindelige mellem scutum og capitulum.En lille mængde hæmolymfe kan være til stede på indramningen efter nålens snit. Pas på ikke at vaccinere luft. Inokuler hunner med svamp suspension mellem låret og kvindens krop ved hjælp af en en-milliliter ultra-fine insulin sprøjte koblet til en 0,3 millimeter nål.Når metarhizium blastospores inokulering udføres mellem låret og kryds kvindelige krop, en lille mængde hæmolymfe kan være til stede på låret efter nålen indsættelse. Pas på ikke at vaccinere luft. Brug gummidelen af en bevinget infusion sat en 0,3 miliimeters kapillær rør og et filter spids til at udføre hæmolymfe indsamling.Forstyrre den kvindelige dorsale neglebånd ved hjælp af en 0,3 millimeter nål. Efter afbrydelse anvende blidt pres på den anterial del af flåt kroppen. Overhold en næsten gennemsigtig væske, der samler sig ud af disruptionstedet.Saml hæmolymfen ved at suge væsken gennem filterspidsen koblet til en gummidel af et bevinget infusionssæt og et 0,3 millimeter kapillærrør. Må ikke trykke på flåten krop næppe under det immobilisering, fordi dette kan forstyrre midgut og forurene hæmolymfen. Vent, indtil det blide tryk kan udvise væsken uden kontaminering.Immobilisere kryds. Skær et stykke af et forben. Et eller flere ben kan skæres samt det samme ben kan skæres mere end én gang.Påfør let tryk på flåtens bageste kropsdel. Overhold en gennemsigtig væskeboble, der dukker op på den afskårne side, og opsaml den med kapillærrøret. Må ikke trykke på flåten krop næppe, under det mobilisering, fordi dette kan forstyrre midgut og forurene hæmolymfen.Vent, indtil det blide tryk kan udvise væsken uden kontaminering. Efter hæmolymfe indsamling, deponere det i 1,5 mililiters mikrorør tidligere fyldt med 30 mikroliter protease cocktail og 82 mikroliter saltvand buffer. Hold mikrorør på is i hele hæmolymfe kollektionen.Centrifuge prøver og den bløde pellet af hæmocytter vil blive dannet efter hæmolymfe centrifugering. For hæmolymfe kvantificering kvantificeres den hæmolymfevolumen, der opnås ved at tælle det samlede volumen inde i mikrorøret, og mængden af proteasecocktail og saltvandsbuffer diskonteres. Fjern forsigtigt den supernatant cellefri hæmolymfe, og re-suspender cellerne forsigtigt.Kvantificer hæmocytterne ved at placere 10 mikroliter re-suspenderet hæmocytter i Neubauer kammer. For celler re-suspension en kultur medier blev brugt. Skær flåtens forreste ben, tryk blidt på flåtens bageste kropsdel, overhold en gennemsigtig væskeboble, der dukker op på klippestedet.Påfør hæmolymfen dråber direkte på rene mikroskop dias. Efter at bruge passende metoder til at plette cellerne. Vaccination mellem benet låret og kryds kvindelige krop kan også skade kryds indre organer såsom midgut og malpighian tubuli.Når kryds midgut forstyrres af nålen på dorsal hemolymph indsamling væsken opnået er rød, ikke gennemsigtig. Dette indikerer en forkert hæmolymfesamling. I så fald skal hemolymfe kasseres, da den er forurenet.Hæmolymfekontaminering kan også observeres, når flåten er naturligt inficeret med store belastninger af patogener, eller i de sidste trin efter dødsprocessen forårsaget af podet patogener. Den hemolymph volumen opnået efter dorsal indsamling er højere end det volumen opnået ved samlingen gennem benet. På trods af, at kontaminering er højere i den første indsamlingsmetode.Hæmocytterkoncentrationen var også betydeligt højere ved dorsalsamlingen. Når korrekt hemocytter samling udføres en god smøre kan opnås, og det er muligt at skelne forskellige hæmocytter efter farvning. Denne video gav oplysninger om metoder til at udføre vaccination af patogen, specielt entomopathogenic svampe, i flåter og indsamle deres hæmolymfe.De teknikker her præsenteres kræver meget lave teknologiske ressourcer i vores klassiske trin for undersøgelser om kryds fysiologi, kryds patologi, og kryds immunrespons. Korrekt høst af leddyrceller, og celle-fri hæmolymfe er afgørende for at give pålidelige oplysninger til efterfølgende undersøgelser. Derfor er det også vigtigt at være opmærksom på de mest almindelige fejl, der er observeret i forbindelse med udførelsen af disse teknikker.Desuden skal forslagene i denne undersøgelse bestemme det mere hensigtsmæssige sted for hemolymfeopsamling ved at deformere eller skære benene i betragtning af forskellen i det opnåede volumen og sandsynligheden for kontaminering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protokoller til vaginal Podning og Prøvetagning i den eksperimentelle musemodel Candida Vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spyt, spytkirtel, og hæmolymfe Collection fra Ixodes scapularis Flåter

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

Det<em&gt; Ex vivo</em&gt; Colon Organ Kultur og dens anvendelse i Antimikrobiel Host Defense Studies

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering og karakterisering af neutrofile-afledte mikropartikler for funktionelle studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Brug af invertebrate Galleria mellonella som en infektions model til undersøgelse af Mycobacterium tuberkulose komplekset

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

En forsinket vaccination Model af kronisk Pseudomonas aeruginosa Sårinfektion

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...