Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Cette étude a été financée en partie par le Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (CAPES) du Brésil, code des Finances 001. CAPES a fourni une bourse de doctorat pour M.A. Marciano. Nous remercions le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) du Brésil d’avoir fourni une bourse de doctorat pour J. Fiorotti. Cette recherche a également été soutenue par des subventions de la Fondation Carlos Chagas Filho pour la recherche de l’état de Rio de Janeiro (FAPERJ) et de CNPq. V.R.E.P. Bittencourt est un chercheur CNPq.

Les tiques utilisées dans la présente étude ont été obtenues à partir d’une colonie artificielle, conduite à l’Université fédérale rurale de Rio de Janeiro, quelles méthodes ont été approuvées par le Comité d’éthique pour l’utilisation des vertébrés (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Cochez les femelles engorgées
<ol><li>Après la cueillette des tiques, lavez les femelles engorgées à l’aide d’eau du robinet et immergez-les dans une solution d’hypochlorite de sod...

<ol>
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L’inoculation d’agents pathogènes est utile lorsque l’étude vise à étudier l’action in vivo des microorganismes dans les modèles expérimentaux d’arthropodes, car elle assure que l’agent pathogène est à l’intérieur de l’hôte. La technique peut également être appliquée pour inoculer des molécules telles que l’interférence d’ARN (RNAi). L’inoculation entre le Scutum et le capitulum est considérée comme plus facile à effectuer mais endommage fréquemment l’orgue de Gené, ce qui comp...

La tique du bétail, Rhipicephalus MICROPLUS, est un hématophage ectoparasite avec un énorme impact négatif sur le bétail dans les zones tropicales. Cette tique est le vecteur d’agents pathogènes tels que Babesia bovis, Babesia bigemina, et Anaplasma marginale qui, combinée avec les dommages hémoalimentaires directs, peut réduire le lait et la production de viande, provoquer l’anémie et, finalement, la mort. Les pertes causées par cette ectoparasite ont été estimées en 3,24 milliards dollars annuellement au Brésil1. Des méthodes durables sont exigées et l’utilisation d’agents entomopathogènes est considérée comme une alternative prometteuse pour réduire l’utilisation des acaricides chimiques2,3,4.
Les champignons entomopathogènes, tels que les Métarhizium spp., sont des ennemis naturels des arthropodes, y compris les tiques, et certains isolats peuvent être utilisés comme biocontrôleurs. Ces agents pathogènes infectent activement l’hôte par la cuticule et colonisent leur corps2,5,6. Au fur et à mesure que l’infection se développe, les réponses cellulaires et humorales sont médiées par le système immunitaire des tiques. L’analyse de l’hémolymphe des tiques est signalée comme un outil utile pour évaluer les réponses immunitaires après les défis avec les pathogènes7,8.
La réponse immunitaire des arthropodes est divisée en réponses humorales et cellulaires. La réponse humorale implique des processus d’hémagglutination et la production de protéines/peptides antimicrobiens, tandis que la réponse immunitaire cellulaire est effectuée à travers les hémocytes. Ces cellules sont présentes dans l’hémolymphe de tous les arthropodes et sont rapportées pour développer un rôle expressif dans les études impliquant la réponse immunitaire innée9, car elle est directement liée aux processus de phagocytose et d’encapsulation. En conséquence, les études sur les hémocytes peuvent aider à enquêter sur la voie de la mort et comprendre les processus tels que l’autophagie, l’apoptose, et la nécrose. Chez certains invertébrés comme les bivalves, la collection des hémocytes fait face à des limitations comme la perturbation cellulaire, le faible volume d’hémolymphe obtenu et la faible concentration des cellules récupérées10. Très fréquemment, selon la méthodologie appliquée, une concentration réduite des cellules est obtenue, affectant directement la quantification et l’analyse des cellules.
Le nombre d’hémocytes circulant dans l’hémolymphe est variable parmi les différents arthropodes et il peut changer dans la même espèce en raison de différents stades physiologiques tels que le sexe, l’âge et l’étape de développement de l’arthropode11. Les hémocytes peuvent également être trouvés collés à certains organes et être libérés en circulation juste après le processus d’infection11. Néanmoins, la plupart des études ont rapporté utiliser des insectes, tandis que les tiques restent moins explorées en ce qui concerne leur physiologie et pathologie. Malgré l’inoculation des pathogènes et la collecte de l’hémolymphe dans les tiques sont des techniques moins utilisées, l’établissement de méthodes standard aide à développer des études plus précises.
Le but de la présente étude était de comparer les méthodes les plus utilisées pour la collecte de l’hémolymphe et l’inoculation des agents pathogènes dans les tiques de R. MICROPLUS , en évaluant l’efficacité dans l’acquisition de l’hémolymphe et la concentration des hémocytes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

Les tiques sont obligatoires ectoparasites hematophages et Rhipicephalus MICROPLUS a une grande importance en médecine vétérinaire parce qu’il provoque l’anémie, perte de poids, l’amortissement du cuir des animaux et peut également agir comme un vecteur de plusieurs agents pathogènes. En raison des coûts exorbitants pour contrôler ces parasites, les dommages à l’environnement causés par l’utilisation inappropriée d’acaricides chimiques, et la résistance accrue contre les parasiticides traditionnels, le contrôle alternatif des tiques, par l’utilisation de les champignons entomopathogènes, par exemple, ont été considérés comme une approche intéressante. Néanmoins, peu d’études ont démontré comment le système immunitaire de la tique agit pour combattre ces entomopathogènes. Par conséquent, ce protocole démontre deux méthodes utilisées pour l’inoculation ENTOMOPATHOGÈNE dans les femelles engorgées et deux techniques utilisées pour la collecte de l’hémolymphe et la récolte des hémocytes. L’inoculation de pathogènes à l’insertion de la jambe dans le corps de la femelle de tique permet l’évaluation des paramètres biologiques femelles contrairement à l’inoculation entre le Scutum et le capitulum, qui endommage fréquemment l’orgue de Gené. La collecte de l’hémolymphe dorsale a donné une récupération plus importante que la collecte par les jambes. Certaines limitations de la collecte et de la transformation de l’hémolymphe des tiques comprennent i) des taux élevés de perturbation des hémocytes, II) une contamination par l’hémolymphe avec un intestin moyen perturbé et III) une faible récupération du volume de l’hémolymphe. Lorsque l’hémolymphe est recueilli par la coupe des jambes, l’hémolymphe prend du temps pour s’accumuler à l’ouverture de la jambe, favorisant le processus de coagulation. En outre, moins d’hémocytes sont obtenus dans la collection par la jambe par rapport à la collection dorsale, même si la première méthode est considérée plus facile à effectuer. La compréhension de la réponse immunitaire dans les tiques médiées par des agents entomopathogènes aide à dévoiler leur pathogenèse et à développer de nouvelles cibles pour le contrôle des tiques. Les processus d’inoculation décrits ici exigent des ressources technologiques très faibles et peuvent être utilisés non seulement pour exposer les tiques à des microorganismes pathogènes. De même, la collecte de l’hémolymphe des tiques peut représenter la première étape pour de nombreuses études physiologiques.

Cet article aborde les méthodes de prélèvement de l’inoculation et de l’hémolymphe appliquées aux tiques. Après l’inoculation entre la cuisse de jambe et le corps de la femelle de tique, un certain liquide (hémolymphe) peut être sécrété pendant le processus; Cependant, il est important de noter que lorsque l’inoculation est terminée, aucun liquide ou aucun tissu n’est présent dans l’embout de l’aiguille ou au site d’inoculation, ce qui garantit que la suspensi...

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Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

L’analyse de l’hémolymphe des tiques représente une source importante d’information sur la façon dont certains agents pathogènes causent la maladie et comment les tiques réagissent immunologiquement à cette infection. La présente étude montre comment inoculer les propagules fongiques et recueillir l’hémolymphe des femelles de Rhipicephalus MICROPLUS engorgés.

Divulgation de la collection d’hémolymphe et inoculation des blastospores de Métarhizium dans les tiques de Rhipicephalus MICROPLUS vers les études de pathologie des invertébrés

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Les tiques sont des ectoparasites hématophagous, Rhipicephalus microplus, populairement connu sous le nom de tique du bétail a un impact économique négatif énorme sur le bétail dans les zones tropicales. En outre, les préoccupations croissantes au sujet des conditions environnementales dégradées et des soucis de santé publique causés par l’utilisation inappropriée d’acaricides chimiques et la résistance croissante des populations de tiques aux parasites traditionnels stimulent la recherche sur d’autres méthodes de lutte, telles que l’utilisation de champignons entomopathogènes. Ces entomopathogènes infectent activement les hôtes arthropodes, par leur cuticule et colonisent leur corps.L’arthropode peut avoir des réponses différentes à l’infection fongique. Le système immunitaire des arthropodes est divisé en réponses humoristiques et cellulaires. La réponse humoristique implique le processus d’hémagglutination et la production de molécules antimicrobiennes, tandis que les hémocytes médient la réponse immunitaire cellulaire.La plupart des études sur la réponse immunitaire des arthropodes sont rapportées à l’aide d’insectes, tandis que les réponses des tiques demeurent moins explorées. En outre, l’inoculation d’agent pathogène et la collecte d’hémolympe de tique sont des techniques mal répandues nécessaires pour mieux comprendre la réponse immunisée de l’arthropode. En conséquence, cette adresse vidéo techniques \used pour filmer l’inoculation, la collection d’hémolymph et le traitement.Puisque la récolte d’hemocytes de tique font face à quelques limitations, telles que la perturbation de cellules, la valeur faible d’hémolymph obtenant, et la basse concentration des cellules récupérées. Infecter directement la configuration et l’analyse des cellules. Après la collecte des tiques, laver les femelles engorgées.Utilisez l’eau du robinet et plongez-les dans une solution hypochlorite à 0,5 % de sodium pendant trois minutes dans un récipient à bécher en verre de 500 millilitres. Pour l’hygiène cuticule, diviser les femelles en groupes homogènes avec 20 femelles chacune. Trois répliques de chaque groupe ont été exécutées.Metarhizium robertsii blastospores ont été utilisés dans le processus d’inoculation. Ajouter sur un liquide de cinq microlitres metarhizium blastospores suspension à la surface d’un film de paraffine en plastique. Pour accélérer le processus d’inoculation, plusieurs bulles peuvent être ajoutées à la surface du film de paraffine en plastique, chaque bulle correspondant à cinq microlitres.Utilisez une seringue à insuline ultra-fine d’un millimètre et une aiguille de 0,3 millimètre pour mettre une suspension et l’inoculer dans la tique. N’oubliez pas de sortir tout l’air de la seringue avant de l’utiliser. Inoculer 5 microlitres de suspension champignon dans la femelle tique entre le scutum et le capitulum.Un petit volume d’hémolympe peut être présent sur le cadrage après l’incision de l’aiguille. Veillez à ne pas inoculer l’air. Inoculer les femelles avec suspension champignon entre la cuisse de la jambe et le corps de la femelle à l’aide d’une seringue d’insuline ultra-fine d’un millilitre couplée à une aiguille de 0,3 millimètre.Lorsque l’inoculation des blastospores de métarhizium est effectuée entre la cuisse de la jambe et le corps de la femelle tique, un petit volume d’hémolympe peut être présent sur la cuisse après l’insertion de l’aiguille. Veillez à ne pas inoculer l’air. Utilisez la partie en caoutchouc d’une infusion ailé définir un tube capillaire de 0,3 miliimeters et une pointe de filtre pour effectuer la collection de hémolympe.Perturber la cuticule dorsale femelle à l’aide d’une aiguille de 0,3 millimètre. Après la perturbation appliquer une pression douce sur la partie antérienne du corps de la tique. Observez une mise en commun liquide presque transparente hors du site de perturbation.Recueillir l’hémolympe en suçant le liquide à travers la pointe du filtre couplé à une partie en caoutchouc d’un ensemble d’infusion ailé et un tube capillaire de 0,3 millimètres. N’appuyez pas sur le corps de la tique à peine pendant son immobilisation, car cela peut perturber le midgut et contaminer l’hémolympe. Attendez que la pression douce puisse expulser le fluide sans contamination.Immobiliser la tique. Coupez un morceau d’une jambe avant. Une ou plusieurs jambes peuvent être coupées ainsi que la même jambe peut être coupée plus d’une fois.Appliquez une pression douce sur la partie postérieure du corps de la tique. Observez une bulle liquide transparente s’afficher sur le côté coupé et recueillez-la avec le tube capillaire. N’appuyez pas sur le corps de la tique à peine, pendant sa mobilisation, car cela peut perturber le midgut et contaminer l’hémolympe.Attendez que la pression douce puisse expulser le fluide sans contamination. Après la collecte de l’hémolympe, déposez-le dans 1,5 microtube de mililiters précédemment rempli de 30 microlitres protéase cocktail et 82 microlitres tampon salin. Gardez les microtubes sur la glace tout au long de la collection d’hémolymph.Des échantillons de centrifugeuses et la pastille molle des ourmocytes seront formés après centrifugation d’hémolympe. Pour la quantification de l’hémolympe, quantifier le volume d’hémolympe obtenu en comptant le volume total à l’intérieur du microtube et en escomptant le volume de cocktail protéase et tampon salin. Retirez soigneusement l’hémolymph sans cellules supernatant et suspendez doucement les cellules.Quantifier les hémocytes en plaçant 10 microlitres d’hémocytes re-suspendus dans la chambre Neubauer. Pour les cellules de re-suspension d’un média de culture a été utilisé. Coupez la jambe avant de la tique, appliquez une légère pression sur la partie postérieure du corps de la tique, observez une bulle liquide transparente s’afficher sur le site de coupe.Appliquez les gouttes d’hémolympe directement sur des lames de microscope propres. Après cela utiliser des méthodes appropriées pour tacher les cellules. L’inoculation entre la cuisse de la jambe et la tique du corps féminin peut également endommager les organes internes des tiques tels que le midgut et les tubules malpighiens.Lorsque le midgut de tique est perturbé par l’aiguille à la collection dorsale d’hémolympe le fluide obtenu est rouge, pas transparent. Cela indique une collection incorrecte d’hémolympe. Dans ce cas, l’hémolympe doit être jeté car il est contaminé.La contamination à l’hémolympe peut également être observée lorsque la tique est naturellement infectée par des charges élevées d’agents pathogènes, ou dans les dernières étapes après le processus de décès causé par des agents pathogènes inoculés. Le volume d’hémolympe obtenu après la collecte dorsale est plus élevé que le volume obtenu lors de la collecte par la jambe. Malgré la facilité de contamination est plus élevé dans la première méthode de collecte.La concentration d’hémocytes était également significativement plus élevée à la collection dorsale. Lorsque la collecte correcte des hémocytes est effectuée un bon frottis peut être obtenu et il est possible de distinguer les ourmocytes différents après coloration. Cette vidéo a fourni des informations sur les méthodes d’inoculation des pathogènes, en particulier les champignons entomopathogènes, dans les tiques et de recueillir leur hémolympe.Les techniques présentées ici nécessitent des ressources technologiques très faibles dans nos étapes classiques pour des études sur la physiologie des tiques, la pathologie des tiques et la réponse immunitaire des tiques. La récolte correcte des cellules d’arthropodes, et de l’hémolymph sans cellules est cruciale pour fournir l’information fiable pour des études suivantes. Pour cette raison, il est également important d’être conscient des erreurs les plus courantes observées dans l’exécution de ces techniques.De plus, les propositions de cette étude détermineront le site le plus approprié pour la collecte de l’hémolympe en déformant ou en coupant les jambes, compte tenu de la différence dans le volume obtenu et de la probabilité de contamination.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

ARN interférence dans les tiques

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Recherche

Immunologie et infection

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