Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

מחקר זה היה ממומן בחלקו על ידי המלון העליון (שכמיות) מברזיל, קוד כספים מספר 001. גלימות סיפקה מלגת דוקטורט עבור A.F. מרציאנו. אנו מודים למועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq) של ברזיל למתן מלגת דוקטורט לג פיורארוטי. מחקר זה היה נתמך גם על ידי מענקים של קרלוס חגיאס קרן Filho לחקר מדינת ריו דה ז'ניירו (FAPERJ) ו CNPq. V.R.E.P. Bittencourt הוא חוקר CNPq.

קרציות ששימשו במחקר הנוכחי התקבלו ממושבה מלאכותית, הנסבית באוניברסיטה הכפרית הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, שיטות שאושרו על ידי הוועדה על אתיקה לשימוש בעלי חוליות (CEUA-IV/UFRRJ037/2014).
1. שנתות הנקבות
<ol><li>לאחר מפגש שנתות, לשטוף את הנקבות הנפוח באמצעות מי ברז לטבול אותם 0.5% (v/v) נתרן היפו?...

<ol>
	<li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil.">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterin&#225;ria. 23 (2), 150-156 (2014).</li><li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins.">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li><li>Camargo, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+for+controlling+Rhipicephalus+microplus+ticks+under+field+conditions.">Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions.</a> Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).</li><li>Perinotto, W. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pathogenicity+of+different+Metarhizium+anisopliae+s.l.+isolates+in+oil+formulations+against+Rhipicephalus+microplus.">In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus.</a> Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).</li><li>Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+insect+epicuticle+degradation+by+entomopathogenic+fungi.">Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).</li><li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+on+the+surface:+Entomopathogenic+fungi+versus+the+insect+cuticle.">Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle.</a> Insects. 4 (3), 357-374 (2013).</li><li>Angelo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+serpins+involved+in+cellular+immune+response+of+Rhipicephalus+microplus+challenged+with+fungi.">Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi.</a> Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).</li><li>De Paulo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhipicephalus+microplus+infected+by+Metarhizium:+unveiling+hemocyte+quantification,+GFP-fungi+virulence,+and+ovary+infection.">Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection.</a> Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).</li><li>Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+and+signalling+in+insect+haemocyte+immunity.">Regulators and signalling in insect haemocyte immunity.</a> Cell Signal. 21, 186-195 (2009).</li><li>Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gon&#231;alves, J., Machado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiaggregant+and+toxic+properties+of+different+solutions+on+hemocytes+of+three+freshwater+bivalves.">Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves.</a> Toxicological &amp; Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).</li><li>Gene, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;moires+de+l'Acad&#233;mie+royale+des+sciences.">M&#233;moires de l'Acad&#233;mie royale des sciences.</a> Torino. 9, 751 (1848).</li><li>Lees, A. D., Beament, J. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+waxing+in+ticks.">An organ waxing in ticks.</a> The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).</li><li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of ticks. , (2014).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemocytes+proliferation+in+larval+silkworm+Bombyx+mori.">Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).</li><li>Bowden, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humoral+immune+systems+of+the+American+lobster+(Homarus+americanus)+and+the+European+lobster+(Homarus+gammarus).">The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus).</a> Fish Research. 186, 367-371 (2017).</li><li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks.">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li><li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immunity+and+its+signaling:+an+overview.">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li><li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks.">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li><li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks.">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).</li><li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva,+salivary+gland,+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks.">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).</li></ol>

החיסונים של פתוגנים הוא שימושי כאשר המחקר שואפת לחקור את הפעולה vivo של מיקרואורגניזמים במודלים פרוקי-רגליים ניסיוני כי זה מבטיח כי הפתוגן הוא בתוך המארח. ניתן להחיל את הטכניקה גם על מולקולות של החיסונים כגון RNA הפרעה (RNAi). החיסון בין הסטום לקפיאולום נחשב לקל יותר לביצוע, אך לעתים קרובות הוא ?...

שנתות הבקר, ריפיקאראוס מיקרופלוס, הוא hematophagus ectoparasite עם השפעה שלילית עצומה על בעלי חיים באזורים טרופיים. שנתות זה הוא וקטור של סוכני פתוגניים כגון babesia סטרפטקוקוס, babesia bigemina, ו אנקלמה מרגיא כי, בשילוב עם הנזק העוצר הישיר, יכול להפחית את ייצור החלב והבשר, לגרום לאנמיה ובסופו של דבר מוות. הפסדים שנגרמו על ידי הפקעון זה הוערך ב3,240,000,000 דולר בשנה בברזיל1. שיטות בר-קיימא הינן מבוקשת והשימוש בסוכני entomopathogenic נחשב חלופה מבטיחה להפחתת השימוש בחומרי הדברה כימיים2,3,4.
פטריות Entomopathogenic, כגון Metarhizium spp., הם אויבים טבעיים של פרוקי רגליים כולל קרציות, וכמה מבודד ניתן להשתמש כמו biocontrollers קרים. פתוגנים אלה באופן פעיל להדביק את המארח דרך קוטיקולה וליישב את גופם2,5,6. ככל שהזיהום מתפתח, תגובות סלולריות ומוסריות מתווכת על ידי המערכת החיסונית שנתות. ניתוח של שנתות המוליקמ הוא דיווח ככלי שימושי כדי להעריך את התגובות החיסונית לאחר מאתגרת עם פתוגנים7,8.
התגובה החיסונית של פרוקי רגליים מחולקת תגובות ומוראלית ו הסלולר. התגובה ההואתית כוללת תהליכים hemagglutination ייצור של חלבונים מיקרוביאלית/פפטידים, בעוד התגובה החיסונית הסלולר מבוצעת דרך הומוציטים. תאים אלה נמצאים המוליקמ מכל פרוקי רגליים והם דיווחו לפתח תפקיד הבעה במחקרים הכרוכים בתגובה החיסונית מולדת9, כפי שהוא קשור ישירות הפאגוציטוזה ותהליכים אנקפסולציה. לפיכך, מחקרים על הומוציטים יכולים לעזור לחקור את נתיב המוות ולהבין תהליכים כגון אוטומטי, אפופטוזיס, ו נמק. ביצורים מסוימים כמו bivalves, אוסף הומוציטים הפנים מגבלות כמו הפרעה לתא, נמוך נפח המוליש השיגה, וריכוז נמוך של תאים התאושש10. לעתים קרובות מאוד, בהתאם למתודולוגיה המוחלת, ריכוז מופחת של תאים מתקבל, להשפיע ישירות על התאים הקוונפיקציה וניתוח.
מספר הומוציטים במחזור המוליקמ הוא משתנה בין פרוקי רגליים שונים, זה יכול לשנות באותו מינים בשל שלבים פיסיולוגיים שונים כגון סקס, גיל, ואת השלב ההתפתחותי של פרוקי הרגליים11. הומוציטים ניתן גם למצוא דבק לאיברים מסוימים ולהיות שוחרר לתוך זרימת הדם רק לאחר תהליך הזיהום11. עם זאת, רוב המחקרים דיווחו על השימוש בחרקים, בעוד שקרציות נשארות פחות בחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה שלהם. למרות הפתוגן ואוסף המוליקמ בקרציות הם פחות טכניקות בשימוש, הקמת שיטות סטנדרטיות מסייעת לפיתוח מחקרים מדויקים יותר.
מטרת המחקר הנוכחי היתה להשוות את השיטות הנפוצות ביותר עבור המוליקמ אוסף וחיסונים של פתוגנים לתוך R. microplus קרציות, הערכת היעילות של רכישת המוליקמ רכש וריכוז הומוציטים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

קרציות הם מחייבים המטפנים ectop, ו המיקרופיקאוס מיקרופלוס יש חשיבות רבה ברפואה וטרינרית כי זה גורם לאנמיה, ירידה במשקל, פחת של עור בעלי חיים גם יכול לשמש וקטור של מספר פתוגנים. בשל העלויות הכרוכות בשליטה בטפילים אלה, נזק לסביבה הנגרמת על ידי שימוש לא הולם בחומר הדברה כימי, והתנגדות מוגברת נגד פרזיטים מסורתיים, שליטה אלטרנטיבית על קרציות, על ידי שימוש ב הפטריות הentomopathogenic, למשל, נחשבה לגישה מעניינת. עם זאת, מחקרים מעטים הוכיחו כיצד המערכת החיסונית של הקרצייה פועל כדי להילחם אלה entomopathogens. לפיכך, פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות המשמשות לentomopathogen חיסונים לנקבות מנוגנות ושתי טכניקות המשמשות עבור אוסף המוליש וקצירת הומוציטים. החיסונים של פתוגנים בכניסה לרגל בגוף של שנתות הנשי מאפשר הערכה של הנשים פרמטרים ביולוגיים בניגוד החיסון בין scuulum לבין הקפיאולום, אשר לעתים קרובות לנזק עוגב של ג ' ו. מעבר לאוסף באמצעות הרגליים הניב התאוששות בנפח גבוה יותר. כמה מגבלות של שנתות המוליקמ האוסף ועיבוד כוללים i) שיעור גבוה של הפרעות הומוציטים, ii) המוליקמ זיהום עם שיבושים באמצע המעיים, ו iii) נמוך המוליקמ האחסון התאוששות. כאשר המוליקמ נאסף באמצעות חיתוך הרגל, המוליש לוקח זמן לצבור בפתיחת הרגל, העדפה תהליך קרישת דם. בנוסף, פחות הומוציטים מתקבלים באוסף דרך הרגל בהשוואה לאוסף הקודם, למרות שהשיטה הראשונה נחשבת קלה יותר לביצוע. הבנת התגובה החיסונית של קרציות בתיווך על ידי סוכני entomopathogenic מסייעת לחשוף פתוגנזה שלהם ולפתח מטרות חדשות עבור שליטה קרציות. תהליכי החיסונים המתוארים כאן דורשים משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד וניתן להשתמש בהם לא רק כדי לחשוף קרציות לאורגניזמים פתוגניים. באופן דומה, את האוסף של שנתות המוליקמ הוא עשוי לייצג את הצעד הראשון עבור מחקרים פיזיולוגיים רבים.

מאמר זה מתקרב לחיסון ושיטות גבייה המוליקמ על קרציות. לאחר החיסון בין ירך הרגל לגוף הנשי, ניתן לפרש חלק מהנוזל (המוליקמ) במהלך התהליך; עם זאת, חשוב לציין כי כאשר החיסון מסתיים, לא נמצאו נוזלים או רקמות בקצה המחט או באתר החיסונים, ומבטיחים כי ההשעיה הפטרייתית מחוסנת לחלוטין. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

ניתוח של שנתות המוליקמ מייצג מקור חשוב של מידע על איך כמה פתוגנים לגרום למחלה וכיצד קרציות מגיבים באופן חיסוני לזיהום זה. המחקר הנוכחי מדגים כיצד לחסן מפיץ פטרייתי ולאסוף המוליםקמ מ הנשים המנוסות מיקרופיאוס .

בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של מטרהיזיפיאוס לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

קרציות הן אקטופארסיטים המטופדים, מיקרופלוס רייפיצפלוס, הידוע בכינויו קרציית הבקר יש השפעה כלכלית שלילית עצומה על בעלי חיים באזורים טרופיים. בנוסף, החששות הגוברים לגבי תנאים סביבתיים מושפלים ודאגות לבריאות הציבור הנגרמות על ידי שימוש לא הולם בתרופות כימיות והתנגדות גוברת של אוכלוסיות קרציות לטפילים מסורתיים, מעוררים מחקר על שיטות בקרה חלופיות, כגון שימוש בפטריות entomopathogenic. אלה entomopathogens באופן פעיל להדביק מארחים פרוקי רגליים, דרך קוטיקל שלהם ליישב את גופם.פרוקי הרגליים עשויים להיות תגובות שונות לזיהום פטרייתי. מערכת החיסון של פרוקי הרגליים מחולקת לתגובות הומוריסטיות ותאיות. התגובה ההומוריסטית כרוכה בתהליך ההמגגלוטינציה וייצור מולקולות מיקרוביאליות, בעוד שהמוציטים מתווים את התגובה החיסונית התאית.רוב המחקרים על התגובה החיסונית של פרוקי רגליים מדווחים באמצעות חרקים בעוד התגובות קרציות להישאר פחות נחקר. כמו כן, חיסון פתוגן ואוסף המולימפה קרציות הן טכניקות נפוצות מאוד הדרושות כדי להבין טוב יותר את התגובה החיסונית של פרוקי הרגליים. בהתאם לכך, טכניקות כתובת וידאו זה \משמש לצלם את החיסון, אוסף hemolymph ועיבוד.מאז hemocytes קרציות קצירת פנים כמה מגבלות, כגון שיבוש תאים, קבלת ערך hemolymph נמוך, ריכוז נמוך של תאים התאושש. מדביק ישירות בתצורה וניתוח של תאים. לאחר איסוף קרציות, לשטוף נקבות שקועות.השתמש במי ברז לטבול אותם 0.5% פתרון hypochlorite נתרן במשך שלוש דקות נמען זכוכית 500 מיליליטר. להיגיינת קוטיקל, מחלקים נקבות בקבוצות הומוגניות עם 20 נקבות כל אחת. בוצעו שלושה שכפולים של כל קבוצה.Metarhizium robertsii blastospores שימשו בתהליך החיסון. הוסף נוזל של חמישה microliters metarhizium blastospores השעיה על פני השטח של סרט פרפין פלסטיק. כדי להאיץ את תהליך החיסון, ניתן להוסיף בועות מרובות למשטח סרט הפרפין מפלסטיק, כל בועה המתאימה לחמישה מיקרוליטרים.השתמש מזרק אינסולין דק במיוחד מילימטר אחד מחט 0.3 מילימטרים לשים השעיה לחסן אותו לתוך הקרצייה. זכור להוציא את כל האוויר מהמזרק לפני השימוש בו. לחסן 5 microliters של השעיית פטרייה לתוך נקבת קרצייה בין scutum ו capitulum.נפח קטן של המולימפה עשוי להיות נוכח על המסגור לאחר חתך המחט. היזהר לא לחסן אוויר. לחסן נקבות עם השעיית פטרייה בין ירך הרגל לבין הגוף של הנקבה באמצעות מזרק אינסולין אחד מיליליטר דק במיוחד יחד עם מחט 0.3 מילימטר.כאשר חיסון metarhizium blastospores מבוצע בין ירך הרגל לבין הגוף של נקבת הקרצייה, נפח קטן של המולימפה יכול להיות נוכח על הירך לאחר החדרת המחט. היזהר לא לחסן אוויר. השתמש בחלק הגומי של עירוי מכונף להגדיר צינור נימי 0.3 miliimeters וק Tip מסנן כדי לבצע את אוסף המולימפה.לשבש את קוטיקל הגב הנשי באמצעות מחט 0.3 מילימטרים. לאחר ההפרעה להפעיל לחץ עדין על החלק לפני הלידה של גוף הקרצייה. שימו לב לנוזל כמעט שקוף המתאגרף מאתר ההפרעה.לאסוף את המולימפה על ידי מציצת הנוזל דרך קצה המסנן יחד לחלק גומי של ערכת עירוי מכונף צינור נימי 0.3 מילימטרים. אל תלחץ על הגוף של הקרצייה בקושי במהלך חוסר התנועה שלה כי זה עלול לשבש את midgut ולזהם את ההמולימפות. המתן עד שלחץ עדין יוכל לגרש את הנוזל ללא זיהום.תשתק את הקרצייה. חותכים חתיכה של רגל קדמית. רגל אחת או יותר ניתן לחתוך, כמו גם את אותה רגל ניתן לחתוך יותר מפעם אחת.יש להפעיל לחץ עדין על חלק הגוף האחורי של הקרצייה. שימו לב לבועה נוזלית שקופה מופיעה בצד החתך ואספו אותה עם צינור נימי. אל תלחץ על הגוף של הקרצייה בקושי, במהלך הגיוס שלה כי זה עלול לשבש את midgut ולזהם את ההמולימפות.המתן עד שלחץ עדין יוכל לגרש את הנוזל ללא זיהום. לאחר איסוף המולימפה, להפקיד אותו 1.5 mililiters microtube מלא בעבר עם 30 קוקטייל פרוטאז microlitres ו 82 microlitres מלוחים חיץ. שמור את המיקרו-צינורות על הקרח לאורך כל אוסף ההמולימפות.דגימות צנטריפוגה ואת גלולה רכה של hemocytes ייווצר לאחר צנטריפוגה המולימפה. לכימות המולימפה, לכמת את נפח המולימפה שהושג על ידי ספירת הנפח הכולל בתוך microtube והנמכת נפח קוקטייל פרוטאז חיץ מלוחים. הסר בזהירות את ההמולימפום נטול התאים העל-טבעי, והשהה בעדינות את התאים.לכמת את hemocytes על ידי הצבת 10 microlitres של hemocytes מושעה מחדש בתא Neubauer. עבור תאים השעיה מחדש נעשה שימוש במדיה תרבותית. חותכים את הרגל הקדמית של הקרצייה, מפעילים לחץ עדין על חלק הגוף האחורי של הקרצייה, מתבוננים בבועה נוזלית שקופה מופיעה באתר החתך.החל את טיפות ההמולימפות ישירות על שקופיות מיקרוסקופ נקי. לאחר מכן להשתמש בשיטות המתאימות כדי להכתים את התאים. חיסון בין ירך הרגל לגוף הנשי הקרצייה יכול גם לגרום נזק לאיברים פנימיים של קרציות כגון מידגוט ופקעות מאלפיג'יות.כאשר מידגוט קרצייה מופרע על ידי המחט באוסף hemolymph הגב הנוזל המתקבל הוא אדום, לא שקוף. הדבר מצביע על אוסף המולימפה שגוי. במקרה זה, המולימפה תיזרק כפי שהוא מזוהם.זיהום hemolymph ניתן לראות גם כאשר הקרצייה נגועה באופן טבעי עם המון גבוה של פתוגנים, או בשלבים הסופיים לאחר תהליך המוות שנגרם על ידי פתוגנים מחוסנים. נפח ההמולימפות המתקבל לאחר איסוף הגב גבוה יותר מהנפח המתקבל באוסף דרך הרגל. למרות ההיכרות של זיהום הוא גבוה יותר בשיטת האיסוף הראשונה.גם ריכוז ההמוציטים היה גבוה משמעותית באוסף הגב. כאשר אוסף hemocytes הנכון מבוצע מריחה טובה ניתן להשיג וניתן להבחין hemocytes שונים לאחר הכתם. וידאו זה סיפק מידע על שיטות לבצע חיסון של פתוגן, במיוחד פטריות entomopathogenic, לתוך קרציות ולאסוף המולימפה שלהם.הטכניקות המוצגות כאן דורשות משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד בצעדים הקלאסיים שלנו למחקרים על פיזיולוגיה של קרציות, פתולוגיה של קרציות ותגובה חיסונית של טיק. הקציר הנכון של תאי פרוקי הרגליים, והמולימפה נטולת תאים חיוניים כדי להרשות לעצמם מידע אמין למחקרים הבאים. מסיבה זו, חשוב גם להיות מודעים לטעויות הנפוצות ביותר שנצפו בביצוע טכניקות אלה.בנוסף, ההצעות של מחקר זה יקבעו את האתר המתאים יותר לאיסוף המולימפה באמצעות עיוות או חיתוך הרגליים, בהתחשב בהבדל בנפח המתקבל ובהסתברות לזיהום.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

RNA התערבות קרציות

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

הפרוטוקולים עבור הרכבת חיסון וגינלי אוסף דוגמאות במודל ניסיוני של עכבר קנדידה דלקת הנרתיק

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; קולון איברי תרבות השימוש בו מארח אנטימיקרוביים ללימודי ביטחון

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Intratracheal חיסון של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

בידוד ואפיון של נויטרופילים, נגזר Microparticles ללימודי פונקציונלי

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...