Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenacão de aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior (CAPES) dal Brasile, finanza Codice 001. CAPES ha fornito il dottorato di studio per A.F. Marciano. Ringraziamo il Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq) del Brasile per aver fornito il dottorato di ricerca per J. Fiorotti. Questa ricerca è stata sostenuta anche da sovvenzioni della Fondazione Carlos Chagas Filho per la ricerca dello stato di Rio de Janeiro (FAPERJ) e CNPq. V.R.E.P. Bittencourt è un ricercatore CNPq.

Le zecche utilizzate nel presente studio sono state ottenute da una colonia artificiale, mantenuto presso l'Università rurale federale di Rio de Janeiro, quali metodi sono stati approvati dalla Commissione per l'etica per l'uso di animali vertebrati (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Tick femmine inghiottite
<ol><li>Dopo la raccolta di tick, lavare le femmine inghiottite utilizzando acqua di rubinetto e immergerli in 0,5% (v/v) soluzione di ipoclorito di sodio per 3 minuti in un 500 mL bicchiere...

<ol>
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L'inoculo dei patogeni è utile quando lo studio mira a indagare l'azione in vivo dei microrganismi nei modelli sperimentali di artropodi perché assicura che l'agente patogeno sia all'interno dell'ospite. La tecnica può essere applicata anche a molecole inoculare come l'interferenza dell'RNA (RNAi). L'inoculo tra lo scutum e il Capitulum è considerato più facile da eseguire ma spesso danneggia l'organo di Gené, compromettendo la vitalità delle uova12,13. Or...

La zecca del bestiame, Rhipicephalus MicroPlus, è un ematofago ectoparassite con un enorme impatto negativo sul bestiame nelle zone tropicali. Questo tick è il vettore di agenti patogeni come Babesia bovis, Babesia bigemina, e Anaplasma marginale che, combinato con il danno emofeeding diretto, può ridurre il latte e la produzione di carne, causare anemia e, infine, la morte. Le perdite causate da questo ectoparassite sono state stimate in 3,24 miliardi dollari all'anno in Brasile1. Sono richiesti metodi sostenibili e l'uso di agenti entomopatogeni è considerato un'alternativa promettente per ridurre l'uso di acaricidi chimici2,3,4.
I funghi entomopatogeni, come il Metarhizium spp., sono nemici naturali di artropodi tra cui zecche, e alcuni isolati possono essere utilizzati come biocontrollori. Questi patogeni infettano attivamente l'ospite attraverso la cuticola e colonizzano il loro corpo2,5,6. Come si sviluppa l'infezione, risposte cellulari e umorali sono mediate dal sistema immunitario tick. L'analisi del tick emolinfa è segnalata come uno strumento utile per valutare le risposte immunitarie dopo la sfida con i patogeni7,8.
La risposta immunitaria degli artropodi è divisa in risposte umorali e cellulari. La risposta umorale coinvolge i processi di emoagglutinazione e la produzione di proteine/peptidi antimicrobici, mentre la risposta immunitaria cellulare viene eseguita attraverso gli emociti. Queste cellule sono presenti nell'emolymph da tutti gli artropodi e sono segnalate per sviluppare un ruolo espressivo in studi che coinvolgono la risposta immunitaria innata9, in quanto è direttamente correlata alla fagocitosi e processi di incapsulamento. Di conseguenza, gli studi sugli emociti possono aiutare a indagare sulla via della morte e comprendere i processi come l'autofagia, l'apoptosi e la necrosi. In alcuni invertebrati come bivalvi, la raccolta degli emociti affronta limitazioni come la rottura delle cellule, il volume di emolymph basso ottenuto e la bassa concentrazione di cellule recuperate10. Molto frequentemente, a seconda della metodologia applicata, si ottiene una riduzione della concentrazione delle cellule, influenzando direttamente la quantificazione e l'analisi delle cellule.
Il numero di emociti circolanti nell'emolymph è variabile tra diversi artropodi e può cambiare nella stessa specie a causa di diversi stadi fisiologici come il sesso, l'età e la fase evolutiva dell'artropodi11. Gli emociti possono anche essere trovati aderiti ad alcuni organi ed essere rilasciati in circolazione subito dopo il processo di infezione11. Tuttavia, la maggior parte degli studi segnalati usano insetti, mentre le zecche rimangono meno esplorate per quanto riguarda la loro fisiologia e patologia. Nonostante l'inoculo patogeno e la raccolta di emolinfa nelle zecche sono tecniche meno utilizzate, stabilire metodi standard aiuta lo sviluppo di studi più accurati.
Lo scopo del presente studio è stato quello di confrontare i metodi più utilizzati per la raccolta di emolimph e l'inoculo di agenti patogeni nelle zecche R. MicroPlus , valutando l'efficacia nell'acquisizione di emolitiche e nella concentrazione di emociti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

Le zecche sono ectoparassiti ematophagous obbligate e Rhipicephalus MicroPlus ha grande importanza nella medicina veterinaria perché provoca anemia, perdita di peso, deprezzamento della pelle degli animali e può anche fungere da vettore di diversi agenti patogeni. A causa dei costi esorbitanti per controllare questi parassiti, danni all'ambiente causati dall'uso improprio di acaricidi chimici, e la maggiore resistenza contro i parassiticidi tradizionali, il controllo alternativo delle zecche, con l'uso di funghi entomopatogeni, ad esempio, è stato considerato un approccio interessante. Tuttavia, pochi studi hanno dimostrato come il sistema immunitario del tick agisce per combattere questi entomopatogeni. Pertanto, questo protocollo dimostra due metodi utilizzati per l'inoculo entomopatogeno in femmine gonfio e due tecniche utilizzate per la raccolta di emolinfa e emociti raccolta. L'inoculo degli agenti patogeni all'inserimento delle gambe nel corpo della femmina di zecca consente la valutazione dei parametri biologici delle femmine a differenza dell'inoculo tra lo scutum e il capitulum, che danneggia frequentemente l'organo di Gené. La collezione di emolinfa dorsali ha prodotto un recupero di volume superiore rispetto alla raccolta attraverso le gambe. Alcune limitazioni di tick emolinfa raccolta ed elaborazione includono i) alti tassi di perturbazione degli emociti, II) contaminazione emolitiche con midgut interrotto, e III) recupero di volume di emolymph basso. Quando l'emolitia viene raccolta attraverso il taglio delle gambe, l'emolitico richiede tempo per accumularsi all'apertura della gamba, favorendo il processo di coagulazione. Inoltre, un minor numero di emociti si ottiene nella raccolta attraverso la gamba rispetto alla raccolta dorsale, anche se il primo metodo è considerato più facile da eseguire. Comprendere la risposta immunitaria nelle zecche mediate da agenti entomopatogeni aiuta a svelare la loro patogenesi e a sviluppare nuovi bersagli per il controllo delle zecche. I processi di inoculo qui descritti richiedono risorse tecnologiche molto basse e possono essere utilizzati non solo per esporre le zecche a microrganismi patogeni. Analogamente, la raccolta di tick emolinfa può rappresentare il primo passo per molti studi fisiologici.

Questo articolo si avvicina metodi di raccolta di inoculo e emolinfa applicati alle zecche. Dopo l'inoculo tra la coscia della gamba e il corpo della femmina di zecca, alcuni fluidi (emolymph) possono essere seccato durante il processo; Tuttavia, è importante notare che quando l'inoculo è terminato, non sono stati presenti liquidi o tessuti nella punta dell'ago o nel sito di inoculo, assicurando che la sospensione fungina sia stata completamente inoculata. Quando il processo di inoculo ...

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Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

L'analisi di tick emolinfa rappresenta un'importante fonte di informazioni su come alcuni patogeni causano malattie e come le zecche rispondono immunologicamente a questa infezione. Il presente studio dimostra come inoculare propagule fungine e raccogliere emolinfa da Rhipicephalus MicroPlus femmine gonfio.

Rivelare la raccolta di hemolymph e l'inoculo di Metarhizium blastospores in Rhipicephalus MicroPlus zecche verso gli studi di patologia degli invertebrati

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Le zecche sono ectoparassiti ematofagi, Rhipicephalus microplus, popolarmente noto come zecca del bestiame ha un enorme impatto economico negativo sul bestiame nelle aree tropicali. Inoltre, le crescenti preoccupazioni per le condizioni ambientali degradate e le preoccupazioni per la salute pubblica causate dall'uso inappropriato di acaricidi chimici e dalla crescente resistenza delle popolazioni di zecche ai parassiti tradizionali, stanno stimolando la ricerca su metodi di controllo alternativi, come l'uso di funghi entomopatogeni. Questi entomopatogeni infettano attivamente gli ospiti degli artropodi, attraverso la loro cuticola e colonizzano il loro corpo.L'artropode può avere risposte diverse all'infezione fungina. Il sistema immunitario degli artropodi è diviso in risposte umoristico e cellulare. La risposta umoristica coinvolge il processo di emoagglutinazione e la produzione di molecole antimicrobiche, mentre gli emociti mediano la risposta immunitaria cellulare.La maggior parte degli studi sulla risposta immunitaria degli artropodi sono riportati usando insetti mentre le risposte alle zecche rimangono meno esplorate. Inoltre, l'inoculazione patogena e la raccolta dell'emolinfa di zecca sono tecniche scarsamente diffuse necessarie per comprendere meglio la risposta immunitaria dell'artropode. Di conseguenza, queste tecniche di indirizzo video\utilizzate per filmare l'inoculazione, la raccolta e l'elaborazione dell'emolinfa.Poiché gli emociti di zecca che raccolgono affrontano alcune limitazioni, come l'interruzione delle cellule, il basso valore dell'emolinfa e la bassa concentrazione di cellule recuperate. Infettare direttamente la configurazione e l'analisi delle celle. Dopo la raccolta delle zecche, lavare le femmine ingoiate.Utilizzare acqua del rubinetto e immergerli in una soluzione di ipoclorito di sodio dello 0,5% per tre minuti in un recipiente di becher di vetro da 500 millilitri. Per l'igiene delle cuticola, dividere le femmine in gruppi omogenei con 20 femmine ciascuna. Sono state eseguite tre repliche di ciascun gruppo.Le blastospore metarhizium robertsii sono state utilizzate nel processo di inoculazione. Aggiungere un liquido di cinque microlitri metarhizium blastospores sospensione sulla superficie di un film di paraffina di plastica. Per accelerare il processo di inoculazione, è possibile aggiungere più bolle alla superficie della pellicola di paraffina di plastica, ogni bolla corrispondente a cinque microlitri.Utilizzare una siringa per insulina ultra-fine di un millimetro e un ago da 0,3 millimetri per mettere una sospensione e inocularla nel segno di spunta. Ricordarsi di esentare tutta l'aria dalla siringa prima di usarla. Inoculare 5 microlitri di sospensione fungino nella femmina tick tra lo scutum e il capitulum.Un piccolo volume di emolinfa può essere presente sull'inquadratura dopo l'incisione dell'ago. Fare attenzione a non inoculare l'aria. Inoculare le femmine con sospensione fungina tra la coscia della gamba e il corpo della femmina utilizzando una siringa di insulina ultra-fine da un millilitro accoppiata a un ago da 0,3 millimetri.Quando l'inoculazione delle blastospore del metarhizium viene eseguita tra la coscia della gamba e il corpo della femmina di zecca, un piccolo volume di emolinfa può essere presente sulla coscia dopo l'inserimento dell'ago. Fare attenzione a non inoculare l'aria. Utilizzare la parte in gomma di un set di infusione alato un tubo capillare da 0,3 miliimetri e una punta del filtro per eseguire la raccolta dell'emolinfa.Interrompere la cuticola dorsale femminile usando un ago di 0,3 millimetri. Dopo l'interruzione applicare una leggera pressione sulla parte anteriore del corpo di zecca. Osserva un pool di liquidi quasi trasparente fuori dal sito di interruzione.Raccogliere l'emolinfa succhiando il liquido attraverso la punta del filtro accoppiata a una parte di gomma di un set di infusione alato e un tubo capillare di 0,3 millimetri. Non premere il corpo del segno di spunta difficilmente durante la sua immobilizzazione perché questo può interrompere il midgut e contaminare l'emolinfa. Attendere che una pressione delicata possa espellere il fluido senza contaminazione.Immobilizza il segno di spunta. Taglia un pezzo di gamba anteriore. Una o più gambe possono essere tagliate così come la stessa gamba può essere tagliata più di una volta.Applicare una leggera pressione sulla parte posteriore del corpo del segno di spunta. Osservare una bolla liquida trasparente che si presenta sul lato tagliato e raccoglierla con il tubo capillare. Non premere il corpo del segno di spunta a malapena, durante la sua mobilitazione perché questo può interrompere il midgut e contaminare l'emolinfa.Attendere che una pressione delicata possa espellere il fluido senza contaminazione. Dopo la raccolta dell'emolinfa, depositarlo in 1,5 mililitri microtubo precedentemente riempito con 30 microlitri proteasi cocktail e 82 microlitri tampone salino. Tieni i microtubi sul ghiaccio per tutta la collezione di emolinfa.I campioni di centrifuga e il pellet morbido di emociti si formeranno dopo la centrifugazione dell'emolinfa. Per la quantificazione dell'emolinfa, quantificare il volume dell'emolinfa ottenuto contando il volume totale all'interno del microtubo e scontando il volume di cocktail proteasi e tampone salino. Rimuovere con cura l'emolinfa supernatante priva di cellule e sospendere delicatamente le cellule.Quantificare gli emociti posizionando 10 microlitri di emociti ri-sospesi nella camera Neubauer. Per le cellule è stato utilizzato un supporto di coltura. Tagliare la gamba anteriore del segno di spunta, applicare una leggera pressione sulla parte posteriore del corpo del segno di spunta, osservare una bolla liquida trasparente sul sito di taglio.Applicare le gocce di emolinfa direttamente sulle diapositive del microscopio pulite. Successivamente utilizzare metodi appropriati per macchiare le cellule. L'inoculazione tra la coscia della gamba e il corpo femminile di zecca può anche danneggiare gli organi interni del segno di spunta come il midgut e i tubuli malpighiani.Quando il midgut di zecca viene interrotto dall'ago nella raccolta dell'emolinfa dorsale, il fluido ottenuto è rosso, non trasparente. Ciò indica una raccolta di emolinfa errata. In questo caso, l'emolinfa deve essere scartata in quanto contaminata.La contaminazione da emolinfa può anche essere osservata quando il segno di spunta è naturalmente infetto da alti carichi di agenti patogeni o nelle fasi finali dopo il processo di morte causate da agenti patogeni inoculati. Il volume dell'emolinfa ottenuto dopo la raccolta dorsale è superiore al volume ottenuto nella raccolta attraverso la gamba. Nonostante l'easiness della contaminazione è più elevato nel primo metodo di raccolta.La concentrazione di emociti era anche significativamente più alta nella collezione dorsale. Quando viene eseguita corretta la raccolta degli emociti è possibile ottenere un buon striscio ed è possibile distinguere diversi emociti dopo la colorazione. Questo video ha fornito informazioni sui metodi per eseguire l'inoculazione di agenti patogeni, in particolare funghi entomopatogeni, nelle zecche e raccogliere la loro emolinfa.Le tecniche qui presentate richiedono risorse tecnologiche molto basse nei nostri passaggi classici per studi sulla fisiologia delle zecche, sulla patologia delle zecche e sulla risposta immunitaria di Tick. La corretta raccolta delle cellule artropodi e l'emolinfa senza cellule è fondamentale per fornire informazioni affidabili per studi successivi. Per questo motivo, è anche importante essere consapevoli degli errori più comuni osservati nell'esecuzione di queste tecniche.Inoltre, le proposte del presente studio determinano il sito più appropriato per la raccolta dell'emolinfa mediante deformazione o taglio delle gambe, considerando la differenza di volume ottenuta e la probabilità di contaminazione.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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