Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

この研究は、ブラジル、金融コード001から Coordenacão ・デ・ Aperfeiçoamento ・デ・ Pessoal ・デ・ Nível ・スーペリア (ケープ) によって部分的に資金を調達しました。ケープは A.F. マルシアノ愛用のための博士奨学金を提供しました。我々は、j. Fiorotti のための博士課程奨学金を提供するブラジルの科学技術開発協議会 (CNPq) に感謝した。この研究は、カルロス・シャーガスフィーリョ国際財団のリオデジャネイロ州 (FAPERJ) および CNPq V.R.E.P. の研究助成金によっても支援されました。ビッテンコートは CNPq の研究者です。

本研究で使用されたダニは人工コロニーから得たもので、活発はリオデジャネイロの連邦農村大学で、脊椎動物の使用に関する倫理委員会によって承認されている (CEUA/UFRRJ #037/2014)。
1. ダニうっ積メス
<ol><li>ダニの収集後、水道水を使用して女性うっ積を洗浄し、0.5% (v/v) 次亜塩素酸ナトリウム溶液に 500 mL ガラスビーカーに3分間、キューティクル衛生のために (<strong c...

<ol>
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病原体が宿主の内部にあることを保証するので、研究が実験節足動物モデルにおける微生物の生体内作用を調査することを目的とする場合に、病原菌の接種が有用である。この技術はまた、RNA 干渉 (RNAi) などの接種分子にも適用することができる。恒星と capitulum の間の接種は、実行が容易であると考えられるが、しばしば臓器 Gené's 損傷を与えるが、卵の生存率12,...

牛のダニ、 Rhipicephalus microplusは、熱帯地域の家畜に巨大な負の影響を与える hematophagus ectoparasite です。このダニは、バベシアボビス、バベシア Bigemina、およびAnaplasma marginaleなどの病原性薬剤のベクターであり、直接 hemofeeding 損傷と組み合わせることにより、乳および食肉生産量を減少させることができ、貧血および究極的には死を引き起こす。この ectoparasite による損失は、ブラジル1年間で32億4000万ドルと見積もられた。持続可能な方法が求められており、entomopathogenic 剤の使用は、化学殺ダニ薬2,3,4の使用を減らすための有望な代替と考えられています。
Metarhizium属などの Entomopathogenic 菌類は、ダニを含む節足動物の天敵であり、biocontrollers として使用することができます。これらの病原体は、表皮を通して宿主に積極的に感染し、彼らの体2、5、6を植民地化する。感染が進行するにつれて、細胞および体液性応答はダニ免疫系によって媒介される。ダニ hemolymph の分析は、病原体7,8に挑戦した後の免疫応答を評価するのに有用なツールとして報告されている。
節足動物の免疫応答は、体液性応答および細胞反応に分けられる。体液性応答には、赤血球凝集反応プロセスおよび抗菌タンパク質/ペプチドの産生が含まれ、一方、細胞性免疫応答は hemocytes を介して行われる。これらの細胞は、すべての節足動物から hemolymph に存在し、それが直接貪食とカプセル化プロセスに関連しているように、先天性免疫応答9を含む研究で表現力豊かな役割を開発するために報告されています。したがって、hemocytes に関する研究は、死の経路を調査し、オートファジー、アポトーシス、壊死などのプロセスを理解するのに役立ちます。一部の無脊椎動物は二枚貝類として、hemocytes のコレクションは、細胞破壊、低 hemolymph 量、および低濃度の回収細胞10のような制限に直面する。非常に頻繁に、適用される方法論に応じて、細胞の減少した濃度が得られ、細胞の定量化および分析に直接影響を与える。
Hemolymph で循環する hemocytes の数は、異なる節足動物の間で変動し、性別、年齢、および節足動物の発達段階11などの異なる生理的段階により同じ種で変化することができる。Hemocytes はまた、いくつかの臓器に付着し、感染プロセス11の直後に循環に放出されることが見出され得る。それにもかかわらず、ほとんどの研究では昆虫の使用が報告され、ダニは生理学や病理に関する調査が少ない。ダニの病原の接種および hemolymph のコレクションはより少なく使用された技術であるにもかかわらず、標準的な方法を確立することはより正確な研究の開発を助ける。
本研究の目的は、hemolymph の収集と病原体の接種のための最も使用された方法をmicroplusティックに比較し、hemolymph 獲得および hemocytes 濃度における有効性を評価することであった。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

ダニは、吸血シソとRhipicephalus microplusは、貧血、体重減少、動物の革の減価償却を引き起こし、またいくつかの病原体のベクターとして作用することができるので、獣医学の非常に重要な義務があります。これらの寄生虫を防除するための法外な費用のために、化学殺ダニ剤の不適切な使用によって引き起こされる環境への損傷、および伝統的な parasiticides に対する抵抗の増加、ダニの代替制御、の使用によるentomopathogenic 菌類は、例えば、興味深いアプローチと考えられてきました。それにもかかわらず, ダニの免疫システムは、これらの entomopathogens と戦うために動作する方法を示しているいくつかの研究.従って、この議定書はうっ積の女性への entomopathogen 接種のために使用される2つの方法および hemolymph のコレクションおよび hemocytes 収穫のために使用される2つの技術を示す。ダニの女性の体の脚の挿入で病原体の接種は、頻繁に Gené's 器官を損傷する恒星と capitulum の間の接種とは異なり、女性の生物学的パラメータの評価を可能にする。背 hemolymph のコレクションは、脚を介したコレクションよりも高いボリュームの回復をもたらした。ダニ hemolymph の収集と処理のいくつかの制限は、i) hemocytes 「破壊」の高いレート、ii) hemolymph 破壊 midgut、および iii) 低 hemolymph ボリュームの回復が含まれます。Hemolymph が足の切断を通して集められるとき、hemolymph は凝固プロセスを支持する足の入り口で集まるために時間を取る。さらに、最初の方法は実行が容易であると考えられるにもかかわらず、背のコレクションと比較して、脚を通してコレクションで得られる hemocytes は少なくなります。Entomopathogenic 剤によって媒介されるマダニにおける免疫応答を理解することは、その病因を明らかにし、ティック制御のための新しい標的を開発するのに役立つ。ここに記載されている接種プロセスは、非常に低い技術資源を必要とし、病原性微生物にダニを暴露するだけでなく使用することができる。同様に、ダニ hemolymph の収集は、多くの生理学的研究のための最初のステップを表すことができる。

本稿はティックに適用された接種と hemolymph の収集方法にアプローチします。脚の大腿とダニの女性の身体の間の接種の後、いくつかの体液 (hemolymph) がプロセス中に分泌される。しかし、接種が終了すると、針の先端または接種部位に液体や組織が存在しなかったため、真菌懸濁液が完全に接種されたことを確認することが重要です。接種プロセスが正しく行われた?...

Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

ダニ hemolymph の分析は、いくつかの病原体が病気を引き起こす方法と、ダニ免疫学的がこの感染症にどのように反応するかに関する重要な情報源を表しています。本研究は、真菌 propagules を接種し、 Rhipicephalus microplusうっ積の雌から hemolymph を採取する方法を示す。

無脊椎動物の病理学研究に向けた Hemolymph のMetarhizium Blastospores の収集とRhipicephalus Microplusダニへの接種の開示

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

ダニは、熱帯地域の家畜に大きなマイナスの経済的影響を及ぼす牛のダニとして知られている、出血性外寄生虫、リピセファルスマイクロプラスです。また、化学アカリシドの不適切な使用や伝統的な寄生虫に対するダニ集団の抵抗力の増加に起因する環境条件の低下や公衆衛生上の懸念が高まり、病原性真菌の使用などの代替制御方法に関する研究を刺激しています。これらの内因病原体は、キューティクルを通して節足動物の宿主に積極的に感染し、身体を植民地化する。節足動物は真菌感染に対して異なる反応を示す可能性がある。節足動物の免疫システムは、体液性および細胞応答に分けられる。体液性応答は、ヘマグルチネーションプロセスと抗菌分子の産生を伴い、ヘモサイトは細胞性免疫応答を媒介する。節足動物の免疫応答に関するほとんどの研究は昆虫を使用して報告され、ダニの応答はあまり探求されていないままです。また、病原体の接種およびダニのヘモリンフ採取は、節足動物の免疫応答をよりよく理解するために必要な広範な技術である。したがって、このビデオアドレス技術\接種、ヘモリンフの収集と処理を撮影するために使用されます。マダニヘモサイトの採取は細胞の破壊、低血球値の取得、回収された細胞の低濃度などのいくつかの制限に直面しているため。細胞の構成と分析に直接感染する。ダニの集まりの後、魅惑的なメスを洗います。水道水を使用し、500ミリリットルのガラスビーカーレシピエントで3分間0.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸します。キューティクルの衛生のために、それぞれ20人の女性と均質なグループで女性を分割します。各グループの3つの複製が実行されました。メタリジウム・ロキシム・ブラストスポアを接種過程で使用した。プラスチックパラフィンフィルムの表面に5マイクロリットルメタリウムブラストスポ懸濁液の液体に追加します。接種プロセスを高速化するために、プラスチックパラフィンフィルム表面に複数の気泡を加えることができる、各気泡は5マイクロリットルに対応する。1ミリメートルの超微細インスリン注射器と0.3ミリメートルの針を使用して、懸濁液を入れ、ダニに接種します。使用する前に、注射器からすべての空気を取り出すことを忘れないでください。5マイクロリットルの真菌懸濁液を、カタムとキャピチュラムの間のダニメスに接種する。少量のヘモリンフが針切開後のフレーミング上に存在する可能性があります。空気を接種しないように注意してください。脚の太ももとメスの体の間に真菌懸濁液を持つ女性を、0.3ミリメートルの針に結合した1ミリリットルの超微細インスリン注射器を使用して接種する。脚の大腿とダニの女性の体の間に接種が行われると、針の挿入後に大腿部に少量のヘモリンが存在する可能性があります。空気を接種しないように注意してください。羽毛注入のゴム部分を0.3ミリメートルの毛細管管およびフィルター先端にセットして、ヘモリンフの収集を行います。0.3ミリメートルの針を使用して女性の手側のキューティクルを破壊します。混乱の後、ダニ体の前部に穏やかな圧力をかける。混乱部位からほとんど透明な液体プールを観察してください。フィルターチップを通して、翼を持つ注入セットのゴム部分と0.3ミリメートルの毛管チューブに結合して液体を吸い込んで、ヘモリンフを収集します。これは、ミドガットを破壊し、ヘモリンパを汚染する可能性があるため、固定化中にダニの体をほとんど押し込まないでください。穏やかな圧力が汚染なしで液体を排出できるまで待ちます。ダニを固定します。前脚の一部を切ります。1つ以上の脚をカットできるだけでなく、同じ脚も複数回切断することができます。ダニの後部身体部分に穏やかな圧力をかける。カット側に透明な液体の泡が現れ、毛細管で回収します。これはミドガットを破壊し、ヘモリンパを汚染する可能性があるため、動員中にダニの体をほとんど押し付けないでください。穏やかな圧力が汚染なしで液体を排出できるまで待ちます。ヘモリンフの収集後、以前に30マイクロリットルプロテアーゼカクテルと82マイクロリットル生理食塩水バッファーで満たされた1.5ミリリットルマイクロチューブに堆積させます。マイクロチューブは、ヘモリンパコレクション全体を通して氷の上に保管してください。遠心分離サンプルと血球の軟質ペレットは、血中リンパ遠心分離後に形成されます。ヘモリンフ定量の場合、マイクロチューブ内の総量を数え、プロテアーゼカクテルと生理食糸バッファーの量を割引することによって得られるヘモリンフ量を定量化する。上清の無細胞のヘモリンパを慎重に取り除き、細胞を穏やかに再中断します。ニューバウアー室に10マイクロリットルの再懸濁血血球を配置して、血球を定量化する。細胞に対して再懸濁液を用いた培養培地を用いた。ダニの前脚をカットし、ダニの後部の身体部分に穏やかな圧力をかけ、カット部位に透明な液体バブルが現れるのを観察する。きれいな顕微鏡のスライドに直接、水リンパの滴を適用します。その後、適切な方法を使用して細胞を染色する。脚の太ももとダニの女性の体の間の接種はまた、ミドガットやマルピギ管などのダニの内臓に損傷を与える可能性があります。ダニの中腸が後回りのヘモリンパコレクションで針によって破壊されると、得られた流体は赤く、透明ではない。これは、誤ったヘモリンパコレクションを示します。この場合、ヘモリンは汚染されたので廃棄されなければならない。マダニが高負荷の病原体に自然に感染した場合、または接種された病原体によって引き起こされる死後の最終段階でも、浸透性汚染が観察される。後方集め後に得られる水回りの容積は、脚を通してコレクションで得られる容積よりも高い。汚染の容易さにもかかわらず、第1の採取方法では高い。また、血球濃度は、後回りコレクションでも有意に高かった。正しい血球の収集が行われると、良好な塗抹標本が得られ、染色後に異なるヘモサイトを区別することが可能となる。このビデオは、病原体、特に病原菌のダニへの接種を行い、そのヘモリンフを収集する方法に関する情報を提供しました。ここで提示された技術は、ダニの生理学、ダニ病理、およびダニの免疫応答に関する研究のための古典的なステップで非常に低い技術リソースを必要とします。節足動物細胞の正しい収穫、および無細胞のヘモリンパは、その後の研究のために信頼できる情報を提供するために重要である。そのため、これらの手法の実行で最も一般的な誤りに注意することも重要です。さらに、本研究の提案は、得られた容積の差と汚染の確率を考慮して、脚の変形または切断を通じて、ヘモリンフ採取のより適切な部位を決定しなければならない。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

ダニのRNA干渉

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

蚊の機能解析のためのカルシウムの生物発光アッセイ（ネッタイシマカ）とダニ（ Rhipicephalus microplus）Gタンパク質共役受容体

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

の実験的マウスモデルにおけるプッシー接種とサンプル採取のためのプロトコルカンジダ膣炎

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

ライム病研究における送信および外因診断法のために動物にダニの摂食

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

ザ<em&gt; ex vivoで</em&gt;コロン器官培養および抗菌生体防御研究におけるその使用

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

野兎病菌 Fischer 344 ラット気管内接種

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

分離と機能研究の好中球由来の微粒子のキャラクタリゼーション

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...