Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Denne studien ble delvis finansiert av Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (KAPPER) fra Brasil, finans kode 001. KAPPER gitt Ph.D. stipend for A.F. Marciano. Vi takker Nasjonalt råd for vitenskapelig og teknologisk utvikling (CNPq) i Brasil for å gi Ph.D. stipend for J. Fiorotti. Denne forskningen ble også støttet av tilskudd av Carlos Chagas Filho Foundation for Research i staten Rio de Janeiro (FAPERJ) og CNPq. V.R.E.P. Bittencourt er en CNPq forsker.

Flått brukt i denne studien ble innhentet fra en kunstig koloni, mantained ved Federal Rural University of Rio de Janeiro, hvilke metoder har blitt godkjent av komiteen for etikk for bruk av virveldyr dyr (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. tick engorged kvinner
<ol><li>Etter tick samling, vaske engorged hunner bruker vann fra springen og dyppe dem i 0,5% (v/v) natrium natriumhypokloritt løsning for 3 min i en 500 mL glass beger mottaker, for cuticle hygiene (figur 1</strong...

<ol>
	<li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil.">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterin&#225;ria. 23 (2), 150-156 (2014).</li><li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins.">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li><li>Camargo, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+for+controlling+Rhipicephalus+microplus+ticks+under+field+conditions.">Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions.</a> Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).</li><li>Perinotto, W. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pathogenicity+of+different+Metarhizium+anisopliae+s.l.+isolates+in+oil+formulations+against+Rhipicephalus+microplus.">In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus.</a> Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).</li><li>Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+insect+epicuticle+degradation+by+entomopathogenic+fungi.">Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).</li><li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+on+the+surface:+Entomopathogenic+fungi+versus+the+insect+cuticle.">Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle.</a> Insects. 4 (3), 357-374 (2013).</li><li>Angelo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+serpins+involved+in+cellular+immune+response+of+Rhipicephalus+microplus+challenged+with+fungi.">Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi.</a> Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).</li><li>De Paulo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhipicephalus+microplus+infected+by+Metarhizium:+unveiling+hemocyte+quantification,+GFP-fungi+virulence,+and+ovary+infection.">Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection.</a> Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).</li><li>Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+and+signalling+in+insect+haemocyte+immunity.">Regulators and signalling in insect haemocyte immunity.</a> Cell Signal. 21, 186-195 (2009).</li><li>Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gon&#231;alves, J., Machado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiaggregant+and+toxic+properties+of+different+solutions+on+hemocytes+of+three+freshwater+bivalves.">Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves.</a> Toxicological &amp; Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).</li><li>Gene, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;moires+de+l'Acad&#233;mie+royale+des+sciences.">M&#233;moires de l'Acad&#233;mie royale des sciences.</a> Torino. 9, 751 (1848).</li><li>Lees, A. D., Beament, J. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+waxing+in+ticks.">An organ waxing in ticks.</a> The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).</li><li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of ticks. , (2014).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemocytes+proliferation+in+larval+silkworm+Bombyx+mori.">Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).</li><li>Bowden, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humoral+immune+systems+of+the+American+lobster+(Homarus+americanus)+and+the+European+lobster+(Homarus+gammarus).">The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus).</a> Fish Research. 186, 367-371 (2017).</li><li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks.">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li><li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immunity+and+its+signaling:+an+overview.">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li><li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks.">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li><li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks.">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).</li><li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva,+salivary+gland,+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks.">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).</li></ol>

Inoculation av patogener er nyttig når studien tar sikte på å undersøke in vivo handling av mikroorganismer i eksperimentelle arthropod modeller fordi det sikrer at organismen er inne i verten. Teknikken kan også anvendes på vaksinere molekyler som RNA interferens (RNAi). Inoculation mellom scutum og capitulum anses lettere å utføre, men ofte skader Gené's organ, svekke eggene levedyktighet12,13. Gené's orgel er anatomisk plassert nær den fremre delen ...

Storfe Tick, Rhipicephalus MicroPlus, er en hematophagus ektoparasitt med en enorm negativ innvirkning på husdyr i tropiske områder. Dette tick er vektoren for patogene midler som Babesia bovis, Babesia Bigemina, og Anaplasma marginale som, kombinert med direkte hemofeeding skade, kan redusere melk og kjøttproduksjon, forårsake anemi og til slutt død. Tap forårsaket av denne ektoparasitt ble anslått i 3 240 000 000 dollar årlig i Brasil1. Bærekraftige metoder er etterspurt og bruk av Entomopathogenic midler er ansett som et lovende alternativ for å redusere bruken av kjemiske acaricides2,3,4.
Entomopathogenic sopp, som Metarhizium spp., er naturlige fiender av leddyr inkludert flått, og noen isolerer kan brukes som biocontrollers. Disse patogener aktivt infisere verten gjennom cuticle og kolonisere kroppen2,5,6. Som infeksjonen utvikler, Cellular og humoral svar er formidlet av tick immunsystem. Analyse av tick hemolymph er rapportert som et nyttig verktøy for å evaluere immunresponsen etter utfordrende med patogener7,8.
Leddyr ' immunrespons er delt inn i humoral og cellulære responser. Humoral respons innebærer hemagglutination prosesser og produksjon av antimikrobielle proteiner/peptider, mens den cellulære immunresponsen utføres gjennom hemocytes. Disse cellene er til stede i hemolymph fra alle leddyr og rapporteres å utvikle en uttrykksfull rolle i studier som involverer medfødt immunrespons9, som det er direkte relatert til fagocytose og innkapsling prosesser. Følgelig kan studier om hemocytes bidra til å undersøke døds forløp og forstå prosesser som autofagi, apoptose og nekrose. I noen virvelløse dyr som muslinger, hemocytes ' samlingen ansikter begrensninger som celleforstyrrelser, lavt hemolymph volum oppnådd, og lav konsentrasjon av gjenopprettede celler10. Svært ofte, avhengig av metodikk anvendt, redusert konsentrasjon av celler er oppnådd, påvirker direkte på celler kvantifisering og analyse.
Antallet hemocytes som sirkulerer i hemolymph er variabel blant ulike leddyr og det kan endre seg i samme art på grunn av ulike fysiologiske stadier som kjønn, alder, og arthropod er utviklingstrinn11. Hemocytes kan også bli funnet overholdt noen organer og bli sluppet inn i omløp like etter smitte prosessen11. Likevel rapporterte de fleste studier bruke insekter, mens flått fortsatt mindre utforsket om deres fysiologi og patologi. Til tross for patogen inoculation og hemolymph samling i flått er mindre brukte teknikker, etablere standard metoder bidrar til utvikling av mer nøyaktige studier.
Målet med denne studien var å sammenligne de mest brukte metodene for hemolymph innsamling og inoculation av patogener i R. MicroPlus flått, evaluere effekten i hemolymph oppkjøpet og hemocytes konsentrasjon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

Flått er forplikte hematophagous ektoparasitter og Rhipicephalus MicroPlus har stor betydning i veterinærmedisin fordi det forårsaker anemi, vekttap, avskrivninger av dyrene ' lær og kan også fungere som en vektor av flere patogener. På grunn av den ublu kostnadene for å kontrollere disse parasitter, skade på miljøet forårsaket av upassende bruk av kjemiske acaricides, og den økte motstanden mot tradisjonelle parasiticides, alternativ kontroll av flått, ved bruk av Entomopathogenic sopp, for eksempel, har vært betraktet som en interessant tilnærming. Likevel har noen studier vist hvordan tick immunsystem fungerer for å bekjempe disse entomopathogens. Derfor demonstrerer denne protokollen to metoder som brukes for entomopathogen inoculation i engorged hunner og to teknikker som brukes for hemolymph innsamling og hemocytes høsting. Inoculation av patogener ved beinet innsetting i tick kvinnens kropp tillater evaluering av kvinner biologiske parametre i motsetning til inoculation mellom scutum og capitulum, som ofte skader Gené's organ. Rygg hemolymph samling ga en høyere volum utvinning enn samlingen gjennom bena. Noen begrensninger av tick hemolymph samling og prosessering inkluderer i) høy forekomst av hemocytes ' avbrudd, II) hemolymph forurensning med forstyrret midttarm, og III) lav hemolymph volum utvinning. Når hemolymph er samlet gjennom beinet skjæring, hemolymph tar tid å akkumulere på beinet åpningen, favoriserer blodpropp prosessen. I tillegg oppnås det færre hemocytes i samlingen gjennom benet i forhold til rygg samlingen, selv om den første metoden anses som lettere å utføre. Forstå immunresponsen i flått formidlet av Entomopathogenic agenter bidrar til å avsløre sine patogenesen og utvikle nye mål for tick kontroll. De inoculation prosessene som beskrives her krever svært lave teknologiske ressurser og kan brukes ikke bare til å utsette flått for patogene mikroorganismer. Tilsvarende kan samlingen av tick hemolymph representerer det første skrittet for mange fysiologiske studier.

Denne artikkelen nærmer seg inoculation og hemolymph innsamlings metoder som brukes på flått. Etter inoculation mellom beinet lår og tick kvinnens kropp, noen væske (hemolymph) kan skilles ut i løpet av prosessen; Det er imidlertid viktig å merke seg at når inoculation er ferdig, ingen væske eller vev var til stede i nålen spissen eller på inoculation stedet, slik at fungal suspensjonen var helt inokulert. Når inoculation prosessen ble riktig utført, gjorde nålen innsetting ...

Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analyse av tick hemolymph representerer en viktig kilde til informasjon om hvordan noen patogener forårsake sykdom og hvordan flått immunologisk svare på denne infeksjonen. Den nåværende studien viser hvordan du vaksinere fungal propagules og samle hemolymph fra Rhipicephalus MicroPlus engorged kvinner.

Avsløre Hemolymph Collection og inoculation av Metarhizium Blastospores inn Rhipicephalus MicroPlus flått mot virvelløse patologi studier

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Ticks er hematophagous ektoparasitter, Rhipicephalus microplus, populært kjent som storfe tick har enorm negativ økonomisk innvirkning på husdyr i tropiske områder. I tillegg stimulerer økende bekymringer om nedbrytede miljøforhold og folkehelsebekymringer forårsaket av upassende bruk av kjemiske akaricider og økende motstand av krysspopulasjoner til tradisjonelle parasitter, forskning på alternative kontrollmetoder, for eksempel bruk av entomopathogenic sopp. Disse entomopathogens aktivt infisere leddyr verter, gjennom deres skjellaget og kolonisere kroppen.Leddyret kan ha forskjellige svar på soppinfeksjonen. Arthropod immunsystem er delt inn i humorale og cellulære svar. Den humorale responsen innebærer hemagglutinasjonsprosess og produksjon av antimikrobielle molekyler, mens hemocytter medierer den cellulære immunresponsen.De fleste studier på leddyr immunrespons rapporteres ved hjelp av insekter mens kryssresponser forblir mindre utforsket. Også patogen inokulasjon og tick hemolymph samling er dårlig utbredt teknikker som er nødvendige for å bedre forstå av leddyr immunrespons. Angav, denne videoen adresse teknikker \ brukes til å filme inokulasjon, hemolymph samling og behandling.Siden tick hemocytes høsting står overfor noen begrensninger, for eksempel celler avbrudd, lav hemolymph verdi oppnå, og lav konsentrasjon av gjenopprettede celler. Direkte infisere på celler konfigurasjon og analyse. Etter tick samling, vask engorged kvinner.Bruk vann fra springen og senk dem ned i 0,5 % natriumhypoklorittoppløsning i tre minutter i en 500 milliliter glassbegermottaker. For cuticle hygiene, del kvinner i homogene grupper med 20 kvinner hver. Tre replikeringer av hver gruppe ble utført.Metarhizium robertsii blastospores ble brukt i inokulasjonsprosessen. Legg på en væske av fem mikroliter metarhizium blastospores suspensjon til overflaten av en plast parafin film. For å øke hastigheten på inokulasjonsprosessen, kan flere bobler legges til plastparafinfilmoverflaten, hver boble som tilsvarer fem mikroliter.Bruk en en millimeter ultra-fin insulinsprøyte og en 0,3 millimeter nål for å sette en suspensjon og inokulere den inn i krysset. Husk å ta all luften ut av sprøyten før du bruker den. Inokuler 5 mikroliter soppsuspensjon i tippekvinnen mellom scutum og kapitulum.Et lite volum hemolymph kan være til stede på innramming etter nåle snitt. Vær forsiktig så du ikke inokulerer luft. Inokulere kvinner med sopp suspensjon mellom beinet låret og kvinnens kropp ved hjelp av en en-milliliter ultra-fin insulin sprøyte kombinert med en 0,3 millimeter nål.Når metarhizium blastospores inokulasjon utføres mellom benet låret og tippen kvinnens kropp, kan et lite volum hemolymph være til stede på låret etter nålen innsetting. Vær forsiktig så du ikke inokulerer luft. Bruk gummidelen av et bevinget infusjonssett et kapillærrør på 0,3 miliimeter og en filterspiss for å utføre hemolymph-kolleksjonen.Forstyrre den kvinnelige dorsale skjellaget ved hjelp av en 0,3 millimeter nål. Etter avbrudd, påfør mildt trykk på den fremre delen av tippekroppen. Vær oppmerksom på en nesten gjennomsiktig væskepooling ut av avbruddsstedet.Samle hemolymph ved å suge væsken gjennom filterspissen drevet til en gummidel av et bevinget infusjonssett og et 0,3 millimeter kapillærrør. Ikke trykk på tippens kropp knapt under immobiliseringen fordi dette kan forstyrre midgut og forurense hemolymph. Vent til mildt trykk kan utvise væsken uten forurensning.Immobilisere krysset. Klipp et stykke av et forben. Ett eller flere ben kan kuttes, så vel som det samme benet kan kuttes mer enn en gang.Påfør mildt trykk på tippens bakre kroppsdel. Vær oppmerksom på at en gjennomsiktig flytende boble vises på den kuttede siden og samle den med kapillærrøret. Ikke trykk på tippens kropp knapt, under det er mobilisering fordi dette kan forstyrre midgut og forurense hemolymph.Vent til mildt trykk kan utvise væsken uten forurensning. Etter hemolymph samling, deponere den i 1,5 mililiters mikrotube tidligere fylt med 30 mikroliter protease cocktail og 82 mikroliter saltvann buffer. Hold mikrorørene på is gjennom hele hemolymph samlingen.Sentrifugeprøver og den myke pelleten av hemocytter vil bli dannet etter hemolymph sentrifugering. For hemolymph kvantifisering, kvantifisere hemolymph volumet oppnådd ved å telle det totale volumet inne i mikrorøret og diskontere volumet av protease cocktail og saltvann buffer. Fjern forsiktig den overnaturlige cellefrie hemolymph, og forsiktig re-suspendere cellene.Kvantifisere hemocytter ved å plassere 10 mikroliter av re-suspendert hemocytter i Neubauer kammeret. For celler re-suspensjon en kultur media ble brukt. Klipp kryssets forben, legg forsiktig trykk på tippens bakre kroppsdel, observere en gjennomsiktig flytende boble vises på det kuttede stedet.Påfør hemolymph dråper direkte på rene mikroskop lysbilder. Deretter bruker du passende metoder for å flekke cellene. Inokulasjon mellom beinet lår og tick kvinnelig kropp kan også skade tick indre organer som midgut og malpighian tubuli.Når tippen midgut forstyrres av nålen på dorsal hemolymph samling væsken oppnådd er rød, ikke gjennomsiktig. Dette indikerer en feil hemolymph samling. I dette tilfellet skal hemolymph kastes som det er forurenset.Hemolymph forurensning kan også observeres når tippen er naturlig infisert med høye belastninger av patogener, eller i de siste trinnene etter dødsprosessen forårsaket av inokulerte patogener. Hemolymph volumet oppnådd etter dorsal samlingen er høyere enn volumet oppnådd på samlingen gjennom beinet. Til tross for at det er lett å kontaminere er høyere i den første innsamlingsmetoden.Hemocytes konsentrasjonen var også betydelig høyere ved dorsal samlingen. Når riktig hemocytes samling utføres en god smøring kan oppnås, og det er mulig å skille forskjellige hemocytter etter farging. Denne videoen ga informasjon om metoder for å utføre inokulasjon av patogen, spesielt entomopathogenic sopp, i flått og samle deres hemolymph.Teknikkene her som presenteres krever svært lave teknologiske ressurser i våre klassiske trinn for studier om kryssfysiologi, krysspatologi og ticks immunrespons. Riktig høsting av leddyrcellene, og cellefri hemolymph er avgjørende for å ha råd til pålitelig informasjon for senere studier. Av den grunn er det også viktig å være klar over de vanligste feilene observert i utførelsen av disse teknikkene.I tillegg skal forslagene i denne studien bestemme det mer hensiktsmessige stedet for hemolymph samling gjennom deformering eller kutting av bena, med tanke på forskjellen i det oppnådde volumet og sannsynligheten for forurensning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protokoller for Vaginal Inokulasjon og Prøvetaking i Experimental mus modell av Candida Vaginitt

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spytt, spyttkjertel, og Hemolymph Collection fra Ixodes Scapularis Flått

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Kultur og dets bruk i Antimicrobial Host forsvarsstudier

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering og karakterisering av nøytrofile-avledet Microparticles for funksjonell studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Bruk av virvelløse Galleria mellonella som en infeksjon modell for å studere Mycobacterium tuberkulose kompleks

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

En forsinket inokulasjonmodell av kroniskpseudomonas aeruginosa sårinfeksjon

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...