Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Это исследование было частично профинансировано Коорденакао-де-Аперфечоаменту де Пессоаль де Нивель (МЫСАМИ) из Бразилии, финансируемым кодексом 001. МЫСЫ условии кандидат стипендии для А.Ф. Марчиано. Мы благодарим Национальный совет по научно-техническому развитию (CNPq) Бразилии за предоставление учености стипендии для J. Фиоротти. Это исследование было также поддержано грантами фонда Карлоса Шагаса Фильхо для исследования штата Рио-де-Жанейро (FAPERJ) и CNPq. В.Р.Е.П. Bittencourt является исследователем CNPq.

Клещи, используемые в настоящем исследовании, были получены из искусственных колоний, манавешенных в федеральном сельском университете Рио-де-Жанейро, какие методы были одобрены Комитетом по этике для использования позвоночных животных (ЦЕУА-IV/UFRРЖ #037/2014).
1. Тик нагруженн...

<ol>
	<li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil.">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterin&#225;ria. 23 (2), 150-156 (2014).</li><li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins.">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li><li>Camargo, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+for+controlling+Rhipicephalus+microplus+ticks+under+field+conditions.">Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions.</a> Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).</li><li>Perinotto, W. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pathogenicity+of+different+Metarhizium+anisopliae+s.l.+isolates+in+oil+formulations+against+Rhipicephalus+microplus.">In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus.</a> Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).</li><li>Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+insect+epicuticle+degradation+by+entomopathogenic+fungi.">Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).</li><li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+on+the+surface:+Entomopathogenic+fungi+versus+the+insect+cuticle.">Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle.</a> Insects. 4 (3), 357-374 (2013).</li><li>Angelo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+serpins+involved+in+cellular+immune+response+of+Rhipicephalus+microplus+challenged+with+fungi.">Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi.</a> Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).</li><li>De Paulo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhipicephalus+microplus+infected+by+Metarhizium:+unveiling+hemocyte+quantification,+GFP-fungi+virulence,+and+ovary+infection.">Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection.</a> Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).</li><li>Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+and+signalling+in+insect+haemocyte+immunity.">Regulators and signalling in insect haemocyte immunity.</a> Cell Signal. 21, 186-195 (2009).</li><li>Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gon&#231;alves, J., Machado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiaggregant+and+toxic+properties+of+different+solutions+on+hemocytes+of+three+freshwater+bivalves.">Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves.</a> Toxicological &amp; Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).</li><li>Gene, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;moires+de+l'Acad&#233;mie+royale+des+sciences.">M&#233;moires de l'Acad&#233;mie royale des sciences.</a> Torino. 9, 751 (1848).</li><li>Lees, A. D., Beament, J. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+waxing+in+ticks.">An organ waxing in ticks.</a> The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).</li><li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of ticks. , (2014).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemocytes+proliferation+in+larval+silkworm+Bombyx+mori.">Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).</li><li>Bowden, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humoral+immune+systems+of+the+American+lobster+(Homarus+americanus)+and+the+European+lobster+(Homarus+gammarus).">The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus).</a> Fish Research. 186, 367-371 (2017).</li><li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks.">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li><li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immunity+and+its+signaling:+an+overview.">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li><li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks.">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li><li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks.">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).</li><li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva,+salivary+gland,+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks.">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).</li></ol>

Инокуляции патогенов полезно, когда исследование направлено на изучение в естественных условиях действия микроорганизмов в экспериментальных членистоногих моделей, поскольку он уверяет, что патоген находится внутри хозяина. Этот метод также может быть применен к прививать молекулы,...

Скотин тик, рипицефалия microplus, является гематофазного эктопаразит с огромным негативным воздействием на скот в тропических районах. Этот Тик является вектором патогенных агентов, таких как баезия Bovis, баезия бигемина, и Анаплазма маргинал , что, в сочетании с прямым повреждением гемокормления, может уменьшить производство молока и мяса, вызвать анемию и в конечном итоге смерть. Убытки, вызванные этой эктопаразит были оценены в 3 240 000 000 долларов в год в Бразилии1. Требуются устойчивые методы, а использование энтомопатогенных агентов считается перспективной альтернативой для сокращения использования в качестве аакацидов,2,3,4.
Энтомопатогенные грибы, такие как Metarhizium СПМ, являются естественными врагами членистоногих в том числе клещей, и некоторые изоляты могут быть использованы в качестве биоконтроллеров. Эти патогены активно заражают хост через кутикулы и колонизировать их тела2,5,6. Как инфекция развивается, клеточных и гуморального ответы опосредовано тик иммунной системы. Анализ тик гемолимф сообщается в качестве полезного инструмента для оценки иммунных реакций после сложной с патогенами7,8.
Иммунный ответ членистоногих делится на гуморальный и клеточных реакций. Гуморальный ответ включает процессы гемагглютинации и выработку противомикробных белков/пептидов, в то время как клеточный иммунный ответ выполняется через гемоциты. Эти клетки присутствуют в гемолимфы от всех членистоногих и, как сообщается, развивать выразительную роль в исследованиях с участием врожденного иммунного ответа9, как это непосредственно связано с фагоцитоз и инкапсуляции процессов. Соответственно, исследования гемоцитов могут помочь исследовать путь смерти и понять процессы, такие как аутофагия, апоптоз и некроза. В некоторых беспозвоночных, как двустворчатые, геоцитов ' коллекция сталкивается с ограничениями, как разрушение клеток, низкий уровень гемолимфы получены, и низкая концентрация восстановленные клетки10. Очень часто, в зависимости от применяемых методик, получается уменьшенная концентрация клеток, воздействуя непосредственно на квантификация и анализ клеток.
Количество гематоцитов, циркулирующих в гемолимфы является переменной среди различных членистоногих и это может измениться в том же виде из-за различных физиологических этапов, таких как пол, возраст, и членистоногих стадии развития11. Гемоциты также могут быть найдены привязаны к некоторым органам и быть освобождены в обращение сразу после процесса заражения11. Тем не менее, большинство исследований сообщили использования насекомых, в то время как клещи остаются менее изучены в отношении их физиологии и патологии. Несмотря на прививку патогена и гемолимфы сбора в клещах менее используемые методы, установление стандартных методов помогает развитию более точных исследований.
Цель настоящего исследования заключалась в том, чтобы сравнить наиболее используемые методы для получения гемолимфы и инокуляции патогенов в R. microplus клещей, оценивая эффективность в приобретении гемолимфы и концентрации гемоцитов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

Клещи являются облигатными гематофазных эктопаразитов и Рипикцефалия microplus имеет большое значение в ветеринарной медицине, потому что это вызывает анемию, потеря веса, обесценение кожи животных, а также может выступать в качестве вектора нескольких патогенов. Из-за непомерных затрат на управление этими паразитами, повреждение окружающей среды, вызванное ненадлежащим использованием химических акарицидов, и усиление резистентности к традиционным паразитам, альтернативный контроль клещей, путем использования Энтомопатогенные грибы, например, считается интересным подходом. Тем не менее, несколько исследований показали, как иммунная система клеща действует для борьбы с этими энтомопатогенами. Таким образом, этот протокол демонстрирует два метода, используемых для энтомопатогена инокуляции в наполненный женщин и двух методов, используемых для гемолимфы сбора и гемоцитов сбора. Прививка патогенных микроорганизмов при вставке ноги в клещевого женского тела позволяет оценить биологические параметры самок в отличие от прививки между потертой и капителями, которые часто повреждает орган Генэ. Спинной гемолимфы коллекции дали более высокий объем восстановления, чем сбор через ноги. Некоторые ограничения на галочку гемолимфы сбора и обработки включают i) высокий уровень нарушения гепатоцитов, II) гемолимфы загрязнения с нарушениями мидгут, и III) низкий уровень гемолимфы восстановления. Когда гемолимфа собирается через ногу резки, гемолимфы требуется время, чтобы накопить на ногу открытия, в пользу свертывания процесса. Кроме того, меньшее количество гемоцитов получают в сборе через ногу по сравнению с спинной коллекции, хотя первый метод считается легче выполнять. Понимание иммунного ответа в клещах, опосредованных энтомопатогенными агентами, помогает раскрыть их патогенез и развить новые цели для контроля клещей. Описанные здесь процессы вакцинации требуют очень низких технологических ресурсов и могут быть использованы не только для выявления клещей до патогенных микроорганизмов. Аналогичным образом, сбор клещей гемолимфы может представлять собой первый шаг для многих физиологических исследований.

Эта статья подходы прививки и гемолимфы методы сбора применительно к клещей. После прививки между ног бедра и клеща женского тела, некоторые жидкости (гемолимфы) могут быть секретируются во время процесса; Однако, важно заметить что когда прививка закончена, никакая ж?...

Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Анализ тик гемолимфа представляет собой важный источник информации о том, как некоторые возбудители вызывают болезни и как клещей иммунологически реагировать на эту инфекцию. Настоящее исследование демонстрирует, как прививать грибковые пропагаты и собирать гемолимфы из Рипицефалии МикроПлюс самок.

Раскрытие гемолимфы сбор и прививка Metarhizium блапопоры в Рипикцефалия Microplus клещей по направлению к патологии беспозвоночных исследований

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Клещи гематофагические эктопараситы, Rhipicephalus microplus, известный в народе как клещ крупного рогатого скота имеет огромное негативное экономическое воздействие на домашний скот в тропических районах. Кроме того, растущая озабоченность по поводу деградированных условий окружающей среды и проблем общественного здравоохранения, вызванных ненадлежащим использованием химических акарицидов и повышением устойчивости популяций клещей к традиционным паразитам, стимулирует исследования альтернативных методов контроля, таких как использование энтомопатогенных грибов. Эти ентомопатогены активно заражают членистоногих хозяев, через их кутикулу и колонизировать их тело.Членистоногий может иметь различные ответы на грибковую инфекцию. Иммунная система членистоногих делится на гуморальные и клеточные реакции. Гуморальный ответ включает в себя процесс гемагглютинации и производство противомикробных молекул, в то время как гемоциты опоясывания клеточного иммунного ответа.Большинство исследований на членистоногих иммунного ответа, как сообщается, с использованием насекомых в то время как клещ ответы остаются менее изучены. Кроме того, патогенная прививка и сбор гемолимф клещей являются плохо распространенными методами, необходимыми для лучшего понимания иммунного ответа членистоногих. Соответственно, этот видео адрес techniques'used для фильма прививки, гемолимфа сбора и обработки.Так как тик гемоцитов сбора сталкиваются с некоторыми ограничениями, такими как нарушение клеток, низкое значение гемолимфа получения, и низкая концентрация восстановленных клеток. Непосредственное заражение конфигурацией и анализом клеток. После сбора клещей, мыть engorged женщин.Используйте водопроводную воду и погрузите их в 0,5% гипохлоритный раствор натрия в течение трех минут в 500 миллилитров стакан получателя. Для гигиены кутикулы, разделить женщин в однородных группах с 20 самок каждая. Было выполнено по три тиража каждой группы.Метаризий робертси бластоспоры были использованы в процессе прививки. Добавьте на поверхность пластиковой парафиновой пленки жидкость из пяти микролитров метаритиза бластоспоров. Чтобы ускорить процесс прививки, несколько пузырьков могут быть добавлены к пластиковой поверхности парафиновой пленки, каждый пузырь, соответствующий пяти микролитров.Используйте одномиллиметровый сверхтонкий инсулиновый шприц и иглу диаметром 0,3 миллиметра, чтобы положить суспензию и привить ее клещу. Не забудьте взять весь воздух из шприца, прежде чем использовать его. Привить 5 микролитров суспензии гриба в клещевой самке между скутом и капитулом.Небольшой объем гемолимфы может присутствовать на обрамлении после разреза иглы. Будьте осторожны, чтобы не прививать воздух. Прививают самок с суспензией гриба между бедром ноги и женским телом с помощью одномиллилитрового сверхтонкого инсулинового шприца в сочетании с иглой диаметром 0,3 миллилитров.Когда метаризий blastospores прививки выполняется между бедром ноги и тело клеща женщины, небольшой объем гемолимфа может присутствовать на бедре после вставки иглы. Будьте осторожны, чтобы не прививать воздух. Используйте резиновую часть крылатого инфузии установить 0,3 милиметра капиллярной трубки и фильтр отзыв для выполнения коллекции гемолимф.Нарушить женскую спинную кутикулу с помощью иглы 0,3 миллиметра. После нарушения нанесите мягкое давление на предродовую часть тела клеща. Наблюдайте за почти прозрачной жидкостью, которая выходит из места нарушения.Соберите гемолимф, сосать жидкость через кончик фильтра в сочетании с резиновой частью крылатого набора настоя и 0,3 миллиметра капиллярной трубки. Не нажимайте тело клеща вряд ли во время его иммобилизации, потому что это может нарушить midgut и загрязнять гемолимфа. Подождите, пока нежное давление может изгнать жидкость без загрязнения.Обездвижить клеща. Отрежьте кусок передней ноги. Одна или несколько ног могут быть сокращены, а также же ноги могут быть сокращены более одного раза.Нанесите мягкое давление на заднюю часть тела клеща. Наблюдайте прозрачный жидкий пузырь, появляйся на разрезанной стороне и собирайте его с капиллярной трубкой. Не нажимайте тело клеща вряд ли, во время его мобилизации, потому что это может нарушить midgut и загрязнять гемолимфа.Подождите, пока нежное давление может изгнать жидкость без загрязнения. После сбора гемолитфа, депозит его в 1,5 милилитров микротрубки ранее заполнены 30 микролитров протеазы коктейль и 82 микролитров солевого буфера. Храните микротрубки на льду по всей коллекции гемолимф.Образцы центрифуг и мягкие гранулы гемоцитов будут образовывания после центрифугации гемолимпы. Для количественной оценки гемолимф количественно объем гемолимфа, полученный путем подсчета общего объема внутри микротрубки и дисконтирования объема протеазы коктейль и солевой буфер. Аккуратно удалите супернатантную гемолимфу без клеток и аккуратно приостановите клетки.Количественная оценка гемоцитов путем размещения 10 микролитров повторно приостановленных гемоцитов в камере Нойбауэра. Для повторной приостановки ячеек использовалось культурное мультимедиа. Отрежьте переднюю ногу клеща, нанесите мягкое давление на заднюю часть тела клеща, наблюдайте прозрачный жидкий пузырь, появляемый на участке разреза.Нанесите капли гемолимфа прямо на чистые слайды микроскопа. После этого используйте соответствующие методы, чтобы испачкать клетки. Прививка между бедром ноги и тик женского тела может также повредить клеща внутренних органов, таких как мидгут и мальпигских трубок.Когда тик midgut нарушается иглы на спинной гемолимфа сбора жидкости, полученной красного цвета, а не прозрачным. Это указывает на неправильную коллекцию гемолимф. В этом случае гемолимфа должна быть отброшена, так как загрязнена.Загрязнение гемолимфой также может наблюдаться, когда клещ естественным образом заражен высокими нагрузками патогенных микроорганизмов, или на заключительных этапах после процесса смерти, вызванного привитых патогенов. Объем гемолимфы, полученный после спинной коллекции, выше объема, полученного в коллекции через ногу. Несмотря на легкость загрязнения выше в первом методе сбора.Концентрация гемоцитов была также значительно выше в спинной коллекции. При правильном сборе гемоцитов можно получить хороший мазок и отличить различные гемоциты после окрашивания. Это видео предоставило информацию о методах выполнения прививки патогена, в частности, ентомопатогенных грибов, в клещей и собирать их гемолимфа.Представленные здесь методы требуют очень низких технологических ресурсов в наших классических шагах для исследований физиологии клещей, патологии клещей и иммунного ответа клеща. Правильная уборка членистоногих клеток и гемолимфа без клеток имеет решающее значение для получения надежной информации для последующих исследований. По этой причине также важно знать о наиболее распространенных ошибках, наблюдаемых при выполнении этих методов.Кроме того, предложения этого исследования должны определить более подходящее место для сбора гемолимф путем деформации или резки ног, учитывая разницу в полученном объеме и вероятность загрязнения.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

РНК-интерференция в клещи

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Анализ кальция Биолюминесценция для функционального анализа Mosquito ( Aedes aegypti) И Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G-белком рецепторы

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Протоколы для Вагинальные Прививка и сбора проб в экспериментальной модели мышей Candida Вагинит

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Кормление клещей на животных для передачи и ксенодиагностика в Лайма исследования заболеваний

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon органной культуры и ее использование в Антимикробная хост оборонных исследований

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Трахею прививка Фишер 344 крыс с Francisella tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Выделение и характеристика нейтрофилов производные микрочастиц для функциональных исследований

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Сбор и обработка лимфатических узлов от крупных животных для анализа РНК: подготовка исследований транскриптомики Лимфоузел крупных видов животных

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...