Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Este estudio fue financiado en parte por el Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível superior (CAPES) de Brasil, código de finanzas 001. La CAPES proporcionó una beca de doctorado para A.F. Marciano. Agradecemos al Consejo Nacional de desarrollo científico y tecnológico (CNPq) de Brasil por proporcionar una beca de doctorado para J. Fiorotti. Esta investigación también fue apoyada por becas de la Fundación Carlos Chagas Filho para la investigación del estado de Río de Janeiro (FAPERJ) y CNPq. V.R.E.P. Bittencourt es un investigador CNPq.

Las garrapatas utilizadas en el presente estudio se obtuvieron de una colonia artificial, mantenida en la Universidad Federal rural de Río de Janeiro, que los métodos han sido aprobados por el Comité de ética para el uso de animales vertebrados (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Marque las hembras engorgadas
<ol><li>Después de la recolección de garrapatas, lavar las hembras engorgadas con agua del grifo y sumergir en 0,5% (v/v) solución de hipoclorito sódico durante 3 min en un recipiente...

<ol>
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La inoculación de patógenos es útil cuando el estudio tiene como objetivo investigar la acción in vivo de microorganismos en modelos de artrópodos experimentales porque asegura que el patógeno está dentro del huésped. La técnica también se puede aplicar para inocular moléculas como la interferencia de ARN (ARNi). La inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum se considera más fácil de llevar a cabo, pero con frecuencia daña el órgano de Genée deteriorar la viabilidad de los óvulos<sup class="xre...

La garrapata del ganado, rhipicephalus microplus, es un ectoparásito hematófago con un enorme impacto negativo en el ganado en las zonas tropicales. Esta garrapata es el vector de agentes patógenos como Babesia bovis, Babesia bigemina, y ANAPLASMA MARGINALE que, combinados con el daño de hemofeeding directo, pueden reducir la producción de leche y carne, causar anemia y finalmente la muerte. Las pérdidas causadas por este ectoparásito se calcularon en 3,24 mil millones dólares anualmente en Brasil1. Se exigen métodos sostenibles y el uso de agentes entomopatógenos se considera una alternativa prometedora para reducir el uso de acaricidas químicos2,3,4.
Los hongos entomopatógenos, como Metarhizium spp., son enemigos naturales de los artrópodos, incluidas las garrapatas, y algunos aislados pueden utilizarse como biocontroladores. Estos patógenos infectan activamente al huésped a través de la cutícula y colonizan su cuerpo2,5,6. A medida que la infección se desarrolla, las respuestas celulares y humorales son mediadas por el sistema inmunológico de la garrapata. El análisis de la garrapata hemolinfa se divulga como una herramienta útil para evaluar las respuestas inmunitarias después del reto con patógenos7,8.
La respuesta inmunitaria de los artrópodos se divide en respuestas humorales y celulares. La respuesta humoral consiste en procesos de hemaglutinación y producción de proteínas/péptidos antimicrobianos, mientras que la respuesta inmunitaria celular se realiza a través de los hemocitos. Estas células están presentes en la hemolinfa de todos los artrópodos y se reportan para desarrollar un papel expresivo en los estudios que implican la respuesta inmune innata9, ya que está directamente relacionado con los procesos de phagocitosis y encapsulación. En consecuencia, los estudios sobre los hemocitos pueden ayudar a investigar la vía de la muerte y comprender procesos como la autofagia, la apoptosis y la necrosis. En algunos invertebrados como bivalvos, la colección de los hemocitos se enfrenta a limitaciones como la alteración celular, el volumen bajo de hemolécula obtenida y la baja concentración de células recuperadas10. Con mucha frecuencia, dependiendo de la metodología aplicada, se obtiene una concentración reducida de células, afectando directamente a la cuantificación y análisis de las células.
El número de hemocitos circulantes en la hemolafila es variable entre los diferentes artrópodos y puede cambiar en la misma especie debido a diferentes etapas fisiológicas como el sexo, la edad, y la etapa de desarrollo del artrópodo11. Los hemocitos también se pueden encontrar adherida a algunos órganos y se liberan en la circulación justo después del proceso de infección11. Sin embargo, la mayoría de los estudios informaron utilizar insectos, mientras que las garrapatas siguen siendo menos exploradas con respecto a su fisiología y patología. A pesar de la inoculación de patógenos y la recolección de hemolinfa en garrapatas son técnicas menos utilizadas, el establecimiento de métodos estándar ayuda al desarrollo de estudios más precisos.
El objetivo del presente estudio fue comparar los métodos más utilizados para la recolección de hemolinfa y la inoculación de patógenos en garrapatas R. microplus , evaluando la eficacia de la adquisición de hemolágenos y la concentración de hemocitos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

Las garrapatas son ectoparásitos hematóviles obligados y rhipicephalus microplus tiene una gran importancia en la medicina veterinaria porque causa anemia, pérdida de peso, depreciación del cuero de los animales y también puede actuar como un vector de varios patógenos. Debido a los costos exorbitantes para controlar estos parásitos, daños al medio ambiente causados por el uso inadecuado de acaricidas químicos, y el aumento de la resistencia contra los parasiticidas tradicionales, control alternativo de las garrapatas, mediante el uso de hongos entomopatógenos, por ejemplo, se ha considerado un enfoque interesante. Sin embargo, pocos estudios han demostrado cómo el sistema inmunológico de la garrapata actúa para luchar contra estos entomopatógenos. Por lo tanto, este protocolo demuestra dos métodos utilizados para la inoculación de entomopatógenos en hembras engorgadas y dos técnicas utilizadas para la recolección de hemológeno y la cosecha de hemocitos. La inoculación de patógenos en la inserción de la pierna en el cuerpo de la hembra de la garrapata permite la evaluación de los parámetros biológicos de las hembras a diferencia de la inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum, que con frecuencia daña el órgano de Genéu. La colección de hemolinfa dorsal produjo una recuperación de mayor volumen que la recogida a través de las piernas. Algunas limitaciones de la recolección y procesamiento de hemolinfa de garrapata incluyen i) altas tasas de alteración de los hemocitos, II) contaminación de la hemolafila con alteraciones en el intestino medio, y III) baja recuperación del volumen de hemolh. Cuando la hemolinfa se recoge a través del corte de la pierna, la hemoléh tarda en acumularse en la abertura de la pierna, favoreciendo el proceso de coagulación. Además, se obtienen menos hemocitos en la colección a través de la pierna en comparación con la colección dorsal, a pesar de que el primer método se considera más fácil de realizar. La comprensión de la respuesta inmune en las garrapatas mediadas por agentes entomopatógenos ayuda a revelar su patogénesis y desarrollar nuevos objetivos para el control de la garrapata. Los procesos de inoculación aquí descritos requieren muy bajos recursos tecnológicos y se pueden utilizar no sólo para exponer las garrapatas a microorganismos patógenos. Del mismo modo, la colección de la hemolafila de garrapata puede representar el primer paso para muchos estudios fisiológicos.

En este artículo se aborda la inoculación y los métodos de recolección de hemolinfa aplicados a las garrapatas. Después de la inoculación entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, un poco de líquido (hemolymph) puede ser secretada durante el proceso; sin embargo, es importante notar que cuando la inoculación está terminada, no hay líquido o tejidos presentes en la punta de la aguja o en el sitio de inoculación, asegurando que la suspensión fúngica ...

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Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

El análisis de la hemolinfa de garrapata representa una importante fuente de información sobre cómo algunos patógenos causan enfermedades y cómo las garrapatas responden inmunológicamente a esta infección. El presente estudio demuestra cómo inocular propágulos fúngicos y recolectar hemolinfa de las hembras engorgadas de rhipicephalus microplus .

Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos, Rhipicephalus microplus, popularmente conocido como la garrapata de ganado tiene un enorme impacto económico negativo en el ganado en las áreas tropicales. Además, las crecientes preocupaciones sobre las condiciones ambientales degradadas y las preocupaciones de salud pública causadas por el uso inapropiado de acaricidas químicos y el aumento de la resistencia de las poblaciones de garrapatas a los parásitos tradicionales, están estimulando la investigación sobre métodos de control alternativos, como el uso de hongos entomopatógenos. Estos entomopatógenos infectan activamente los huéspedes artrópodos, a través de su cutícula y colonizan su cuerpo.El artrópodo puede tener diferentes respuestas a la infección fúngica. El sistema inmunitario artrópodo se divide en respuestas humorales y celulares. La respuesta humoral implica el proceso de hemaglutinación y la producción de moléculas antimicrobianas, mientras que los hemocitos median la respuesta inmune celular.La mayoría de los estudios sobre la respuesta inmunitaria artrópoda se notifican utilizando insectos, mientras que las respuestas a las garrapatas permanecen menos exploradas. Además, la inoculación de patógenos y la recolección de hemolímpia de garrapatas son técnicas poco extendidas necesarias para comprender mejor la respuesta inmunitaria del artrópodo. En consecuencia, este video address techniques-used para filmar la inoculación, la colección de hemólimpas y el procesamiento.Dado que la recolección de hemocitos de garrapatas enfrenta algunas limitaciones, como la interrupción de las células, la obtención de un valor bajo de hemolymph y la baja concentración de células recuperadas. Infectar directamente en la configuración y el análisis de las células. Después de la recolección de garrapatas, lave a las hembras engordadas.Use agua del grifo y sumerjala en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% durante tres minutos en un recipiente de vaso de precipitados de vidrio de 500 mililitros. Para la higiene de la cutícula, divida las hembras en grupos homogéneos con 20 hembras cada una. Se realizaron tres réplicas de cada grupo.Metarhizium robertsii blastosporas se utilizaron en el proceso de inoculación. Añadir un líquido de cinco microlitros metarhizium blastospores suspensión a la superficie de una película de parafina de plástico. Para acelerar el proceso de inoculación, se pueden añadir múltiples burbujas a la superficie de película de parafina de plástico, cada burbuja correspondiente a cinco microlitros.Utilice una jeringa de insulina ultrafina de un milímetro y una aguja de 0,3 milímetros para colocar una suspensión e inocularla en la garrapata. Recuerde sacar todo el aire de la jeringa antes de usarla. Inocular 5 microlitros de suspensión de hongos en la garrapata hembra entre el escutum y el capitulo.Un pequeño volumen de hemolymph puede estar presente en el encuadre después de la incisión de la aguja. Tenga cuidado de no inocular el aire. Inocular a las hembras con suspensión de hongos entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra utilizando una jeringa de insulina ultrafina de un mililitro acoplada a una aguja de 0,3 milímetros.Cuando la inoculación de las blastosporas de metarhizium se realiza entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, un pequeño volumen de hemolymph puede estar presente en el muslo después de la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no inocular el aire. Utilice la parte de goma de una infusión alada establecer un tubo capilar de 0,3 miliimetros y una punta de filtro para realizar la colección de hemolímpido.Interrumpir la cutícula dorsal femenina con una aguja de 0,3 milímetros. Después de la interrupción, aplique una presión suave sobre la parte anterial del cuerpo de la garrapata. Observe una agrupación líquida casi transparente fuera del sitio de interrupción.Recoger la hemolymph chupando el líquido a través de la punta del filtro acoplado a una parte de goma de un conjunto de infusión alado y un tubo capilar de 0,3 milímetros. No presione el cuerpo de la garrapata apenas durante su inmovilización porque esto puede interrumpir el punto medio y contaminar la hemolímpido. Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el líquido sin contaminación.Inmoviliza la garrapata. Corta un trozo de una pierna delantera. Una o más piernas se pueden cortar, así como la misma pierna se puede cortar más de una vez.Aplique una presión suave sobre la parte posterior del cuerpo de la garrapata. Observe que una burbuja líquida transparente aparece en el lado cortado y recójala con el tubo capilar. No presione el cuerpo de la garrapata apenas, durante su movilización porque esto puede interrumpir el punto medio y contaminar la hemolímpido.Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el líquido sin contaminación. Después de la recolección de hemólimpas, depositarlo en 1,5 mililitros microtubo previamente lleno de 30 microlitros de cóctel proteasa y 82 microlitros tampón de solución salina. Mantenga los microtubos sobre hielo durante toda la colección de hemólimpos.Las muestras de centrífuga y el pellet suave de los hemocitos se formarán después de la centrifugación de la hemolímplo. Para la cuantificación de la hemolímpida, cuantifique el volumen de hemolímpido obtenido contando el volumen total dentro del microtubo y descontando el volumen de cóctel proteasa y tampón salino. Retire con cuidado la hemolinfa libre de células y vuelva a suspender suavemente las células.Cuantifique los hemocitos colocando 10 microlitros de hemocitos re-suspendidos en la cámara Neubauer. Para la re-suspensión de las células se utilizó un medio de cultivo. Cortar la pierna delantera de la garrapata, aplicar una presión suave en la parte posterior del cuerpo de la garrapata, observar una burbuja líquida transparente aparecen en el sitio de corte.Aplique las gotas de hemólimpa directamente en las diapositivas limpias del microscopio. Después de eso, utilice los métodos apropiados para manchar las células. La inoculación entre el muslo de la pierna y la garrapata del cuerpo femenino también puede dañar los órganos internos de la garrapata, como la parte media y los túbulos malpighianos.Cuando la garrapata en la parte media de la torcha es interrumpida por la aguja en la colección de hemólimpa dorsal, el líquido obtenido es rojo, no transparente. Esto indica una colección de hemolymph incorrecta. En este caso, la hemolímpido se desechará a medida que esté contaminada.La contaminación por hemolímpla también se puede observar cuando la garrapata está infectada naturalmente con altas cargas de patógenos, o en los pasos finales después del proceso de muerte causado por patógenos inoculados. El volumen de hemolymph obtenido después de la colección dorsal es mayor que el volumen obtenido en la colección a través de la pierna. A pesar de la facilidad de contaminación es mayor en el primer método de recolección.La concentración de hemocitos también fue significativamente mayor en la colección dorsal. Cuando se realiza la correcta colección de hemocitos se puede obtener un buen frotis y es posible distinguir diferentes hemocitos después de la tinción. Este video proporcionó información sobre los métodos para realizar la inoculación del patógeno, específicamente los hongos entomopatógenos, en las garrapatas y recoger su hemolímpia.Las técnicas aquí presentadas requieren recursos tecnológicos muy bajos en nuestros pasos clásicos para los estudios sobre la fisiología de las garrapatas, la patología de las garrapatas y la respuesta inmunitaria de la garrapata. La correcta recolección de las células artrópodas y la hemolímpia libre de células es crucial para ofrecer información confiable para estudios posteriores. Por esta razón, también es importante ser consciente de los errores más comunes observados en la ejecución de estas técnicas.Además, las propuestas de este estudio determinarán el lugar más apropiado para la recolección de hemólimpas mediante la deformación o corte de las piernas, teniendo en cuenta la diferencia en el volumen obtenido y la probabilidad de contaminación.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

La interferencia de ARN en las garrapatas

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Un ensayo de bioluminiscencia de calcio para el análisis funcional de los Mosquitos ( Aedes aegypti) Y Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados a proteínas

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocolos para la inoculación dentro de la vagina y toma de muestras en el modelo experimental de ratón de Candida Vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

La saliva, la glándula salival, y la Colección hemolinfa de las garrapatas Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

La alimentación de las garrapatas de los animales para Transmisión y xenodiagnóstico en Lyme Investigación de Enfermedades

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

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los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organo cultura y su uso en estudios de defensa antimicrobiana de host

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

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Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

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Un modelo de inoculación tardía de la infección crónica por la herida de Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...