Name: disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Denna studie finansierades delvis av Coordenacão de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES) från Brasilien, ekonomi kod 001. CAPES gav doktors stipendium för AF Marciano. Vi tackar nationella rådet för vetenskaplig och teknisk utveckling (CNPq) i Brasilien för att ge Ph.D. stipendium för J. Fiorotti. Denna forskning stöddes också av bidrag av Carlos Chagas Filho stiftelsen för forskning i delstaten Rio de Janeiro (FAPERJ) och CNPq. V.R.E.P. Bittencourt är en CNPq forskare.

Fästingar som användes i den här studien erhölls från en konstgjord koloni, som manades på federal Rural University of Rio de Janeiro, vilka metoder har godkänts av etik kommittén för användning av ryggradsdjur (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Tick svullna Honor
<ol><li>Efter fästing insamling, tvätta svullna Honor med kran vatten och sänk dem i 0,5% (v/v) natriumhypoklorit lösning för 3 min i en 500 mL glas bägare mottagare, för nagelband hygien (figur 1</...

<ol>
	<li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil.">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterin&#225;ria. 23 (2), 150-156 (2014).</li><li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins.">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li><li>Camargo, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metarhizium+anisopliae+for+controlling+Rhipicephalus+microplus+ticks+under+field+conditions.">Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions.</a> Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).</li><li>Perinotto, W. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pathogenicity+of+different+Metarhizium+anisopliae+s.l.+isolates+in+oil+formulations+against+Rhipicephalus+microplus.">In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus.</a> Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).</li><li>Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+insect+epicuticle+degradation+by+entomopathogenic+fungi.">Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).</li><li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+on+the+surface:+Entomopathogenic+fungi+versus+the+insect+cuticle.">Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle.</a> Insects. 4 (3), 357-374 (2013).</li><li>Angelo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+serpins+involved+in+cellular+immune+response+of+Rhipicephalus+microplus+challenged+with+fungi.">Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi.</a> Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).</li><li>De Paulo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhipicephalus+microplus+infected+by+Metarhizium:+unveiling+hemocyte+quantification,+GFP-fungi+virulence,+and+ovary+infection.">Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection.</a> Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).</li><li>Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+and+signalling+in+insect+haemocyte+immunity.">Regulators and signalling in insect haemocyte immunity.</a> Cell Signal. 21, 186-195 (2009).</li><li>Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gon&#231;alves, J., Machado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiaggregant+and+toxic+properties+of+different+solutions+on+hemocytes+of+three+freshwater+bivalves.">Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves.</a> Toxicological &amp; Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).</li><li>Gene, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;moires+de+l'Acad&#233;mie+royale+des+sciences.">M&#233;moires de l'Acad&#233;mie royale des sciences.</a> Torino. 9, 751 (1848).</li><li>Lees, A. D., Beament, J. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+waxing+in+ticks.">An organ waxing in ticks.</a> The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).</li><li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of ticks. , (2014).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemocytes+proliferation+in+larval+silkworm+Bombyx+mori.">Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).</li><li>Bowden, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humoral+immune+systems+of+the+American+lobster+(Homarus+americanus)+and+the+European+lobster+(Homarus+gammarus).">The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus).</a> Fish Research. 186, 367-371 (2017).</li><li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks.">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li><li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immunity+and+its+signaling:+an+overview.">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li><li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks.">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li><li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks.">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).</li><li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva,+salivary+gland,+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks.">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).</li></ol>

Inympning av patogener är användbart när studien syftar till att undersöka in vivo åtgärder av mikroorganismer i experimentella leddjur modeller eftersom det försäkrar att patogenen är inne i värden. Tekniken kan också användas för att vaccinera molekyler som RNA-interferens (RNAi). Ympning mellan skölden och capitulum anses lättare att utföra men ofta skadar genés organ, försämrar äggen livs kraft12,13. Genés orgel är anatomiskt placerad n?...

Boskapen fästing, Rhipicephalus MicroPlus, är en hematophagus Ektoparasit med en enorm negativ inverkan på boskap i tropiska områden. Denna fästing är vektorn av patogena ämnen såsom Babesia bovis, Babesia bigemina, och Anaplasma marginale som i kombination med direkt hemofeeding skador, kan minska mjölk och kött produktion, orsaka anemi och slutligen död. Förluster orsakade av denna Ektoparasit uppskattades i 3 240 000 000 dollar årligen i Brasilien1. Hållbara metoder krävs och användningen av Entomopathogenic agenter anses vara ett lovande alternativ för att minska användningen av kemiska akaricider2,3,4.
Entomopathogenic svampar, såsom Metarhizium spp., är naturliga fiender av leddjur inklusive fästingar, och vissa isolat kan användas som biocontrollers. Dessa patogener infektera aktivt värden genom nagelbanden och kolonisera sin kropp2,5,6. När infektionen utvecklas, cellulära och humorala svar förmedlas av fästing immun systemet. Analys av Tick hemolymfa rapporteras som ett användbart verktyg för att utvärdera immun svar efter utmanande med patogener7,8.
Leddjur immun svar är uppdelad i humorala och cellulära svar. Den humorala reaktionen involverar hemagglutinationshämmande processer och produktion av antimikrobiella proteiner/peptider, medan cellulär immun svar utförs genom hemocyter. Dessa celler är närvarande i hemolymfa från alla leddjur och rapporteras att utveckla en uttrycksfull roll i studier med medfödda immun svar9, eftersom det är direkt relaterat till fagocytos och inkapsling processer. Följaktligen, studier om hemocyter kan bidra till att undersöka död väg och förstå processer såsom autophagy, apoptos, och nekros. I vissa ryggradslösa djur som biventiler, hemocyter samling ansikten begränsningar som cell störningar, låg hemolymfa volym erhålls, och låg koncentration av återvunna celler10. Mycket ofta, beroende på tillämpad metod, erhålls minskad koncentration av celler, vilket direkt påverkar cellernas kvantifiering och analys.
Antalet hemocyter som cirkulerar i hemolymfa varierar mellan olika leddjur och det kan förändras i samma art på grund av olika fysiologiska stadier såsom kön, ålder, och artropod utvecklingsstadium11. Hemocyter kan också hittas följs vissa organ och släppas ut i omlopp strax efter infektionen process11. Ändå, de flesta studier rapporterade använda insekter, medan fästingar förbli mindre utforskade om deras fysiologi och patologi. Trots patogen inympning och hemolymfa insamling i fästingar är mindre använda tekniker, upprättande av standard metoder hjälper utvecklingen av mer exakta studier.
Syftet med den här studien var att jämföra de mest använda metoderna för hemolymfa insamling och inympning av patogener i R. MicroPlus fästingar, utvärdera effekten i hemolymfa förvärv och hemocyter koncentration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Alkaline Hypochlorite solution</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">A1727</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Synth</td>
			<td style="width:158px;">2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flexible rubber</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">48900-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:116px;">CTechGlass</td>
			<td style="width:158px;">CT95-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Insulin syringe (needle)</td>
			<td style="width:116px;">BD</td>
			<td style="width:158px;">SKU:&#160;324910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Leibovitz&#39;s L-15 culture medium&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microtubes</td>
			<td style="width:116px;">BRAND</td>
			<td style="width:158px;">Z336769-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET014593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Neubauer chamber&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Kasvi</td>
			<td style="width:158px;">K5-0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:158px;">15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:158px;">P2714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tween 80</td>
			<td style="width:116px;">Vetec</td>
			<td style="width:158px;">60REAVET003662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies

Fästingar är obligate hematophagous ektoparasiter och Rhipicephalus MicroPlus har stor betydelse inom veterinär medicinen eftersom det orsakar anemi, viktminskning, avskrivning av djurens läder och även kan fungera som en vektor av flera patogener. På grund av de orimliga kostnaderna för att kontrol lera dessa parasiter, skador på miljön som orsakats av olämplig användning av kemiska akaricider, och det ökade motståndet mot traditionella parasiticider, alternativ kontroll av fästingar, genom användning av Entomopathogenic svampar, till exempel, har ansetts vara en intressant metod. Ändå har få studier visat hur Tick immun systemet agerar för att bekämpa dessa entomopathogens. Därför visar detta protokoll två metoder som används för entomopathogen inympning i svullna honor och två tekniker som används för hemolymfa insamling och hemocyter skörd. Inympning av patogener vid benet insättning i fäs tingen kvinnlig kropp tillåter utvärdering av Honor biologiska parametrar till skillnad från inympning mellan skölden och capitulum, som ofta skadar genés orgel. Dorsal hemolymfa insamling gav en högre volym återhämtning än insamling genom benen. Vissa begränsningar av Tick hemolymfa insamling och bearbetning inkluderar i) höga hemocyter störningar, II) hemolymfa förorening med störd midgut, och III) låg hemolymfa volym återhämtning. När hemolymfa samlas in genom benet styckning, den hemolymfa tar tid att ackumuleras vid ben öppningen, gynnar Koagulations processen. Dessutom erhålls färre hemocyter i samlingen genom benet jämfört med rygg kollektionen, även om den första metoden anses lättare att utföra. Förstå immun svaret i fästingar medierade av Entomopathogenic agenter hjälper till att avslöja deras patogenes och utveckla nya mål för Tick kontroll. De inympningsprocesser som beskrivs här kräver mycket låga tekniska resurser och kan användas inte bara för att exponera fästingar för patogena mikroorganismer. Likaså kan insamlingen av fästing hemolymfa representera det första steget för många fysiologiska studier.

Denna artikel närmar sig inympning och hemolymfa insamlings metoder tillämpas på fästingar. Efter inympningen mellan benet lår och fäs tingen kvinnans kropp, kan en del vätska (hemolymfa) utsöndras under processen; Det är dock viktigt att notera att när inympningen är avslutad, ingen vätska eller vävnader fanns i nålspetsen eller på inokuleringsstället, se till att svamp SUS pensionen var helt inokuleras. När inympningprocessen utfördes korrekt, inte nålen insättning i...

Watch this Scientific Journal Video about Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies at JoVE.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analys av Tick hemolymfa utgör en viktig källa till information om hur vissa patogener orsaka sjukdom och hur fästingar immunologiskt reagera på denna infektion. Den nuvarande studien visar hur man Inokulera svamp diasporer och samla hemolymfa från rhipicephalus MicroPlus svullna Honor.

Avslöja Hemolymfa insamling och inympning av Metarhizium blastospores till Rhipicephalus MicroPlus fästingar mot ryggradslösa patologi studier

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Fästingar är hematophagous ektoparasiter, Rhipicephalus microplus, populärt kallad nötkreatur fästingen har enorma negativa ekonomiska inverkan på boskap i tropiska områden. Dessutom är ökande oro för nedgraderade miljöförhållanden och folkhälsooro som orsakas av olämplig användning av kemiska akaricider och ökande resistens av fästingpopulationer till traditionella parasiter, stimulera forskning om alternativa kontrollmetoder, såsom användning av entomopatogena svampar. Dessa entomopathogens infektera aktivt leddjur värdar, genom deras nagelband och kolonisera sin kropp.Leddjuret kan ha olika svar på svampinfektionen. Leddjur immunsystemet är indelad i humorala och cellulära svar. Den humorala svar innebär hemagglutination process och produktion av antimikrobiella molekyler, medan hemocyter förmedla cellulära immunsvar.De flesta studier på leddjur immunsvar rapporteras med hjälp av insekter medan fästing svar förblir mindre utforskade. Också, patogen inokulering och fästing hemolymph insamling är dåligt utbredda tekniker som är nödvändiga för att bättre förstå leddjurs immunsvar. Följaktligen, denna video adress tekniker\används för att filma inokulering, hemolymph insamling och bearbetning.Eftersom tick hemocyter skörden möta vissa begränsningar, såsom celler störningar, låg hemolymph värde erhålla, och låg koncentration av återvunna celler. Direkt infektera på celler konfiguration och analys. Efter fästingsamling, tvätta engorged honor.Använd kranvatten och sänk ned dem i 0,5 %natriumhypokloritlösning i tre minuter i en 500 milliliters glasbägare mottagare. För nagelbandshygien, dela upp honor i homogena grupper med 20 honor vardera. Tre replikat av varje grupp utfördes.Metarhizium robertsii blastospores användes i inokulering processen. Lägg på en vätska av fem mikroliter metarhizium blastosporer suspension till ytan av en plast paraffin film. För att påskynda inokuleringsprocessen kan flera bubblor läggas till plastparaffinfilmytan, varje bubbla som motsvarar fem mikroliter.Använd en en millimeters ultrafin insulinspruta och en 0,3 millimeters nål för att sätta en suspension och inokulera den i fästet. Kom ihåg att ta all luft ur sprutan innan du använder den. Inokulera 5 mikroliter av svamp suspension i fästingen hona mellan scutum och kapitulum.En liten volym av hemolymph kan vara närvarande på inramningen efter nålantalet. Var försiktig så att inte luft inokuleras. Inokulera honor med svamp suspension mellan benet låret och honans kropp med en en-milliliter ultrafin insulinspruta kopplade till en 0,3 millimeter nål.När metarhizium blastosporer inokulering utförs mellan benet låret och fästingen kvinnans kropp, en liten volym av hemolymph kan vara närvarande på låret efter nålen insättning. Var försiktig så att inte luft inokuleras. Använd gummidelen av en bevingad infusionsset en 0,3 miliimeters kapillärrör och en filterspets för att utföra hemolymf-samlingen.Störa den kvinnliga rygg nagelband med hjälp av en 0,3 millimeter nål. Efter störningar applicerar försiktigt tryck på den anterial delen av fästkroppen. Observera en nästan genomskinlig vätska som slår ut från störningsplatsen.Samla hemolymph genom att suga vätskan genom filterspetsen kopplade till en gummidel av en bevingad infusionsset och en 0,3 millimeter kapillärrör. Tryck inte på fästingens kropp knappast under det är immobilisering eftersom detta kan störa midgut och förorena hemolymph. Vänta tills ett försiktigt tryck kan utvisa vätskan utan kontaminering.Immobilisera fästet. Skär en bit av ett framben. Ett eller flera ben kan skäras samt samma ben kan skäras mer än en gång.Applicera försiktigt tryck på fästingens bakre kroppsdel. Observera en transparent flytande bubbla dyker upp på den skurna sidan och samla den med kapillärröret. Tryck inte på fästingens kropp knappast, under det är mobilisering eftersom detta kan störa midgut och förorena hemolymph.Vänta tills ett försiktigt tryck kan utvisa vätskan utan kontaminering. Efter hemolymph samling, deponera den i 1,5 mililiters microtube tidigare fylld med 30 microlitres proteas cocktail och 82 microlitres saltlösning buffert. Håll mikrorör på is hela hemolymph samlingen.Centrifugera prover och den mjuka pelleten av hemocyter kommer att bildas efter hemolymph centrifugering. För hemolymph kvantifiering, kvantifiera hemolymph volym som erhållits genom att räkna den totala volymen inuti mikroröret och diskontering volymen av proteas cocktail och saltlösning buffert. Ta försiktigt bort den supernatant cellfria hemolymph, och försiktigt åter upphäva cellerna.Kvantifiera hemocyterna genom att placera 10 mikroliter återuppskjutna hemocyter i Neubauerkammaren. För celler re-suspension en kultur media användes. Skär fästingens främre ben, applicera försiktigt tryck på fästingens bakre kroppsdel, observera en transparent flytande bubbla dyka upp på snittplatsen.Applicera hemolymph droppar direkt på rena mikroskop diabilder. Efter att använda lämpliga metoder för att färga cellerna. Inokulering mellan benet lår och fästing kvinnliga kroppen kan också skada fästing inre organ som midgut och malpighian tubuli.När fästingen midgut störs av nålen vid dorsala hemolymph samling den vätska som erhålls är röd, inte transparent. Detta indikerar en felaktig hemolymph samling. I detta fall ska hemolymf kasseras eftersom den är kontaminerad.Hemolymph kontaminering kan också observeras när fästet är naturligt infekterade med höga belastningar av patogener, eller i de sista stegen efter döden process orsakad av inokulerade patogener. Den hemolymfvolym som erhålls efter dorsala samlingen är högre än den volym som erhålls vid samlingen genom benet. Trots enkelheten i kontaminering är högre i den första insamlingsmetoden.Hemocyterna koncentrationen var också betydligt högre vid dorsala samlingen. När korrekt hemocyter insamling utförs ett bra utstryk kan erhållas och det är möjligt att skilja olika hemocyter efter färgning. Denna video som information om metoder för att utföra inokulering av patogen, specifikt entomopathogenic svampar, i fästingar och samla in sina hemolymph.De tekniker som presenteras här kräver mycket låga tekniska resurser i våra klassiska steg för studier om fästingfysiologi, fästing patologi och fästingens immunsvar. Den korrekta skörden av leddjurscellerna, och cellfri hemolymf är avgörande för att ha råd med tillförlitlig information för efterföljande studier. Av den anledningen är det också viktigt att vara medveten om de vanligaste misstagen som observerats vid utförandet av dessa tekniker.Dessutom skall förslagen från denna studie fastställa det lämpligare området för hemolymfinsamling genom deformering eller kapning av benen, med tanke på skillnaden i den erhållna volymen och sannolikheten för kontaminering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

RNA Interference in Ticks

RNA-interferens i Fästingar

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

En Kalcium bioluminescence-analys för funktionsanalys av Mosquito ( Aedes aegypti) Och Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G proteinkopplade receptorer

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Protokoll för vaginal Inokulation och Provtagning i den experimentella musmodell av Candida Vaginit

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliv, spottkörtel och hemolymfa Collection från Ixodes scapularis fästingar

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Riktad Differentiering av inducerade pluripotenta stamceller mot T-lymfocyter

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Utfodring av fästingar på djur för Transmission och Xenodiagnosis i Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

De<em&gt; Ex vivo</em&gt; Colon orgel kultur och dess användning i Antimicrobial värdförsvaret Studies

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering och karakterisering av neutrofiler-derived mikropartiklar för funktionella studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Användning av ryggradslösa Galleria mellonella som en infektions modell för att studera den Mycobacterium tuberkulos Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

En fördröjd inokulering modell av kronisk pseudomonas aeruginosa Sår infektion

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...