Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

Vi vil gerne takke medlemmerne af laboratorierne i Andrew fire og Mark Kay for vejledning og forslag.

Dyreforsøg blev godkendt af det institutionelle dyrepleje-og anvendelses udvalg under University of Washington.
Forberedelse af små RNA-biblioteker
1. RNA-isolation
<ol><li>Isoler RNA fra en biologisk kilde ved hjælp af et standard RNA-isolations reagens eller et sæt, der beriger for microRNAs. For væv, er det bedst at starte med prøver snap-frosne i flydende kvælstof og jorden til et pulver ved hjælp af en præ-kølet mørt...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

Trods identifikationen af microRNAs over 20 år siden13, processen med MicroRNA sekvensering forbliver omstændelig og kræver specialiseret udstyr, hindrer laboratorier fra rutinemæssigt at vedtage in-House protokoller14. Andre teknikker kan samtidig evaluere microRNAs, ligesom microRNA mikroarrays og multiplexed udtryks paneler; Men, disse tilgange er begrænset i, at de kun kvantificere microRNAs til stede i deres sonde sæt. På grund af dette, de savner vigtige funkti...

Først opdaget i 19931, det anslås nu, at næsten 2000 microRNAs er til stede i det menneskelige genom2. Micrornas er små ikke-kodning RNAs, der typisk er 21-24 nukleotider lang. De er post-transkriptionelle regulatorer af genekspression, ofte bindende til komplementære steder i den 3-ikke-oversat region (3-UTR) af Target gener til at undertrykke protein udtryk og forringe mRNA. Kvantificering af microRNAs kan give værdifuld indsigt i genekspression, og flere protokoller er blevet udviklet til dette formål3.
Vi har udviklet en defineret, reproducerbar og mangeårig protokol til små RNA-sekvensering og til analyse af normaliserede læsninger ved hjælp af open source bioinformatik værktøjer. Vigtigere er, at vores protokol muliggør samtidig identifikation af både endogene microRNAs og eksogent leverede konstruktioner, der producerer microRNA-lignende arter, mens minimere læser, der kort til andre små RNA arter, herunder ribosomale RNAs ( rRNAs), overførsel af RNA-afledte små RNAs (tsRNAs), gentagne afledte små RNAs-og mRNA-nedbrydningsprodukter. Heldigvis, microRNAs er 5-phosphorylated og 2-3 hydroxyleret4, en funktion, der kan udnyttes til at adskille dem fra disse andre små RNAs og mRNA nedbrydningsprodukter. Flere kommercielle muligheder findes for microRNA kloning og sekvensering, der er ofte hurtigere og lettere at multiplex; men den proprietære karakter af kit reagenser og deres hyppige modifikationer gør sammenligning prøvekørsler udfordrende. Vores strategi optimerer indsamlingen kun den korrekte størrelse af microRNAs gennem acrylamid og agrose gel rensning trin. I denne protokol beskriver vi også en procedure for justering af sekvens læsninger til microRNAs ved hjælp af open source-værktøjer. Dette sæt af instruktioner vil være særligt nyttigt for nybegyndere Informatik brugere, uanset om vores bibliotek forberedelse metode eller en kommerciel metode anvendes.
Denne protokol er blevet anvendt i flere offentliggjorte undersøgelser. For eksempel, det blev brugt til at identificere den mekanisme, hvormed Dicer enzym spalter små hårnål RNAs i en afstand af to nukleotider fra den interne løkke af stammen-loop struktur-den såkaldte "loop-Counting regel"5. Vi har også fulgt disse metoder til at identificere den relative overflod af leverede små hårnål RNAs (shRNA) udtrykt fra rekombinant adeno-associerede virale vektorer (rAAVs), at identificere tærsklen for shRNA udtryk, der kan tolereres før leveren toksicitet forbundet med overskydende shRNA-udtryk6. Ved hjælp af denne protokol, vi også identificeret microRNAs i leveren, der reagerer på fraværet af microRNA-122-en højt udtrykt hepatisk microRNA-samtidig kendetegner nedbrydningen mønster af denne microRNA7. Fordi vi har brugt vores protokol konsekvent i talrige eksperimenter, har vi været i stand til at observere prøve præparater i længderetningen, og se, at der ikke er nogen mærkbar batch effekter.
I deling af denne protokol, vores mål er at give brugerne mulighed for at generere høj kvalitet, reproducerbar kvantificering af microRNAs i stort set alle væv eller cellelinje, ved hjælp af overkommelige udstyr og reagenser, og gratis bioinformatik værktøjer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

Halvdelen af alle menneskelige udskrifter menes at være reguleret af microRNAs. Derfor kan kvantificering af microRNA-ekspression afsløre underliggende mekanismer i sygdomstilstande og give terapeutiske mål og biomarkører. Her, vi detaljer, hvordan man præcist kvantificere microRNAs. Kort, denne metode beskriver isolerende microRNAs, ligating dem til adaptere egnet til high-gennemløb sekvensering, forstærke de endelige produkter, og forberede et eksempel bibliotek. Derefter forklarer vi, hvordan man justerer de opnåede sekvensering læser til microRNA Hårnåle, og kvantificere, normalisere, og beregne deres differens udtryk. Alsidig og robust, denne kombinerede eksperimentelle workflow og bioinformatik analyse giver brugerne mulighed for at begynde med vævs ekstraktion og finish med MicroRNA kvantificering.

Skematisk af trin involveret i Biblioteks forberedelse En overordnet skematisk lille RNA-ekstraktion, sekvensering og justering er skitseret i figur 2. Leverprøver fra en mandlig og en kvindelig mus blev indsamlet og snap frosset i flydende nitrogen. Total RNA blev ekstraheret og evalueret for kvalitet og koncentration.
Lille RNA-sekvensering giver tilstrækkelig RNA ...

Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Her beskriver vi en trinvis strategi for isolering af små RNAs, berigende for microRNAs og klargøring af prøver til sekvensering med høj gennemløb. Vi beskriver derefter, hvordan man behandler sekvens læsninger og justerer dem til microRNAs ved hjælp af open source-værktøjer.

En komplet pipeline til isolering og sekvensering af MicroRNAs og analyse af dem ved hjælp af open source-værktøjer

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Vi har udviklet en defineret, reproducerbar og mangeårig protokol for små RNA-sekventering og til analyse af normaliserede læsninger ved hjælp af opensource bioinformatik værktøjer. De vigtigste fordele ved vores strategi er, at den præcist indsamler mikroRNA'er gennem gelrensning, og at bioinformatikanalysen kan anvendes, uanset hvordan mikroRNA'erne indsamles. Høj overførselssekvensering af microRNAs kan afsløre indsigt i sygdomsmekanismer, behandling af mikroRNA'er og den nøjagtige kvantificering af genterapi tilgange, der leverer små RNA'er.Sørg for at arbejde i et RNase frit miljø og for at holde alle RNA-produkterne på is under hele proceduren. Visualisering af gelskæringstrinnene vil hjælpe seerne med at identificere den korrekte størrelse af de produkter, der kræves til downstream-applikationer. For tre prime adapter ligation, kombinere 11 mikroliter af RNA med 1,5 mikroliter af ATP fri 10X T4RNA ligase reaktion buffer, en mikroliter af polyethylenglycol, og 0,5 mikroliter af tre prime linker.Prøverne opvarmes ved 95 grader Celsius på en termocyr i 30 til 40 sekunder efterfulgt af afkøling på is i et minut. Tilføj en mikroliter af T4RNA ligase to og inkuber reaktionen ved stuetemperatur i to timer. Mens prøverne inkuberes, hældes en 15% polyayrilamid gel mellem 0,8 millimeter adskilte glasplader i en plast støbt og indsætte en kam.Når gelen er størknet, tilsættes 0,5 5X TBE til tanken og pipette kraftigt for at vaske brøndene af resterende urinstof. Efter forløb af polyakrylamidgelen i 25 minutter ved 375 volt, og prøverne efterlades mindst én vognbane mellem hver prøve. Læg 20 mikroliter af mindst to sæt markører i et asymmetrisk mønster for at holde styr på gelens retning og køre gelen ved en konstant 375 volt.Efter 15 minutter, stige til en konstant 425 volt for resten af kørslen og køre gelen i omkring to timer. I slutningen af kørslen skal du bruge en pladeseparator til at fjerne gelen fra glaspladerne og placere gelen på en plastiksidebeskytter. Fortynde fem mikroliter af ethidiumbromid i 500 mikroliter destilleret vand og tilsæt farvestoffet på markørbanerne lige over den øverste lyseblå markør.Brug derefter et rent barberblad til at skære gelerne fra den øverste til nederste markør i hver vognbane under ultraviolet lys og overføre stykkerne til en fire gange fire centimeter kvadrat af laboratorieforseglingsfilm. Skær gelen med omkring tre snit vandret og to snit lodret for at producere 12 små firkanter. Der tilsættes 400 mikroliter 0,3 molarnatriumchlorid på tætningsfilmen, og gelstykkerne guides i 1,5 milliliterssikoniumsrør.Agitere prøverne på en møtrikker ved fire grader Celsius natten over. Næste morgen overføres 400 mikroliter af hver supernatant til nye rør. Der tilsættes en milliliter 100 % ethanol og en mikroliter på 15 mg/ml glykogen medfedtningsmiddel pr. rør.Derefter opbevares rørene på minus 80 grader Celsius i en time. For fem prime linker ligation, først dreje ned optøede prøver og resuspend pellets i vand. Dernæst tilsættes 0,5 mikroliter af 100 mikromolar fem prime linker, en mikroliter T4RNA ligase buffer, en mikroliter på 10 millimolar ATP og en mikroliter polyethylenglycol til hver prøve.Varm reaktionerne ved 90 grader Celsius i 30 sekunder, før de anbringes på is. Derefter tilsættes en mikroliter af T4RNA ligase en til hvert rør og inkubere reaktionerne ved stuetemperatur i to timer. Ved omvendt transskription indsamles prøverne ved centrifugering og opsuspendere den lufttørrede pellet i 8,25 mikroliter kernefrit vand.Tilføj 0,5 mikroliter af 100 micromolar omvendt transskription primer og fem mikroliter af 2X omvendt transskription reaktion mix fra en supplerende DNA syntese kit. Efter tre minutter ved 42 grader Celsius, tilsæt 1,5 mikroliter af 10X omvendt transskriptionsenzym til hver prøve for en 30 minutters inkubation ved 42 grader Celsius i en termocykler. Efter neutralisering, forberede en PCR-reaktion med 29,5 mikroliter vand, fem mikroliter 10X taq buffer, en mikroliter nukleosid triphosphat, to mikroliter af 25 mikromolar frem primer, to mikroliter af 25 mikromolar omvendt primer, 0,5 mikroliter taq polymerase, og 10 mikrolitere af den omvendte transskriberet DNA.Kør derefter to PCR-reaktioner. For agarose gel rensning, forberede en 4% agarose gel med lav smeltning agarose og belastning 40 mikroliter eller mere af PCR produkt på gelen med lastning farvestof og 100 base par og 25 base par størrelse markører. Efter at have kørt gelen, skæres båndet over 125 base par bånd og bruge en gel ekstraktion kit i henhold til producentens anvisninger.Ryst for at opløse gelbåndet i buffer ved stuetemperatur, før det relevante udstyr anvendes til at kvantificere det endelige sekvensbibliotek. Brug derefter de relevante opensource bioinformatikværktøjer til at analysere sekvensdataene. I denne repræsentative PCR-reaktion på lavsmeltet agarosegel kan der observeres erhvervelse af det korrekte klonede produkt sammenlignet med det opnåede linkerlinkerprodukt og umættede kontra mættede prøver.Efter justering til humane microRNA hårnåle, en stærk konkordans mellem microRNA læse tæller i hver replikat kan observeres. I alt 306 mikroRNA-arter blev påvist med det største antal læserkortlægning til microRNA 122. Det er vigtigt at huske at skære gelerne i den rigtige størrelse for at muliggøre en nøjagtig genopretning af mikroRNA'erne.Efter sekventering af microRNAs, kan brugerne anvende en bioinformatik analyse til at karakterisere fordelingen af microRNAs inden for deres væv af interesse. Denne teknik er blevet brugt til at identificere, hvordan microRNAs behandles, og hvilke sæt mikroRNA'er ændres i visse kræftformer. Sørg for at udvise forsigtighed, når du håndterer ethidiumbromid, og når man ser på gelerne under ultraviolet lys.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Genetics

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isoleret og høj overførselshastighed sekventering bibliotek konstruktion til Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Målrettet næste generation Sequencing og bioinformatik rørledningen for at evaluere genetiske determinanter for forfatningsmæssige sygdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjælden begivenhed registrering ved hjælp af fejl-korrigeret DNA og RNA sekventering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En hurtig og letkøbt Pipeline for generering af genomisk punkt mutanter i C. elegans bruger CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input Genome Sequencing bibliotek forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøvemateriale

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, sekventering og analysere ekstracellulære MicroRNA fra humane mesenkymale stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering af mRNA fra fuldblod ved hjælp af Nanopmalm sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massespektrometri-baseret Proteomics analyser ved hjælp af OpenProt Database til at afsløre nye proteiner oversat fra ikke-kanoniske åbne læserammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...