Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

We willen de leden van de laboratoria van Andrew Fire en Mark Kay bedanken voor hun begeleiding en suggesties.

Dierproeven werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Washington.
Kleine RNA bibliotheek voorbereiding
1. RNA-isolatie
<ol><li>Isoleer RNA van een biologische bron met behulp van een standaard RNA-isolatie reagens of een kit die verrijkt wordt voor Microrna's. Voor weefsels, het is het beste om te beginnen met monsters snap-bevroren in vloeibare stikstof en gemalen tot een poed...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

Ondanks de identificatie van microRNAs meer dan 20 jaar geleden13, blijft het proces van microRNA-sequencing bewerkelijk en vereist gespecialiseerde apparatuur, waardoor laboratoria worden gehinderd om routinematig in-House protocollen14te hanteren. Andere technieken kunnen gelijktijdig Microrna's evalueren, zoals microRNA micro arrays en Multiplexed expressie panelen; deze benaderingen zijn echter beperkt omdat ze alleen de microRNAs in hun testset kwantificeren. Hierdoor ...

Voor het eerst ontdekt in 19931, is nu geschat dat bijna 2000 Microrna's aanwezig zijn in het menselijk genoom2. Microrna's zijn kleine niet-Codeer Rna's die meestal 21-24 nucleotiden lang zijn. Het zijn posttranscriptionele regulatoren van genexpressie, vaak bindend voor complementaire locaties in de 3-onvertaalde regio (3-UTR) van doel genen om eiwit expressie te onderdrukken en mRNA te degraderen. Het kwantificeren van Microrna's kan waardevol inzicht geven in genexpressie en er zijn verschillende protocollen voor dit doel ontwikkeld3.
We hebben een gedefinieerd, reproduceerbaar en lang staand protocol ontwikkeld voor kleine RNA-sequencing en voor het analyseren van genormaliseerde leesbewerkingen met open source bioinformatica tools. Belangrijk is dat ons protocol de gelijktijdige identificatie van zowel endogene Microrna's als exogenously geleverde constructies die microRNA-achtige soorten produceren mogelijk maakt, terwijl leest die naar andere kleine RNA-soorten, waaronder ribosomale Rna's ( rRNAs), overdracht van RNA-afgeleide kleine Rna's (Tsrna's), herhaald afgeleide kleine Rna's, en mRNA afbraakproducten. Gelukkig zijn microrna's 5-fosforyleerd en 2-3 gehydroxyleerde4, een functie die kan worden gebruikt om ze te scheiden van deze andere kleine rna's en mRNA afbraakproducten. Er bestaan verschillende commerciële opties voor het klonen en sequentiëren van microRNA die vaak sneller en gemakkelijker te multiplex zijn; echter, de gepatenteerde aard van Kit reagentia en hun frequente modificaties maakt het vergelijken van monster runs uitdagend. Onze strategie optimaliseert het verzamelen van alleen de juiste grootte van Microrna's door middel van acrylamide en agarose gel zuiveringsstappen. In dit protocol beschrijven we ook een procedure voor het uitlijnen van sequentie lezen op microRNAs met behulp van open source tools. Deze set instructies zal vooral nuttig zijn voor beginnende informatica gebruikers, ongeacht of onze bibliotheek bereidingsmethode of een commerciële methode wordt gebruikt.
Dit protocol is gebruikt in verschillende gepubliceerde studies. Het werd bijvoorbeeld gebruikt om het mechanisme te identificeren waarmee het dicer-enzym kleine haarspeld Rna's op een afstand van twee nucleotiden uit de interne lus van de stuurlus structuur-de zogenoemde "lustellings regel"5. We volgden ook deze methoden om de relatieve overvloed van geleverde kleine haarspeld Rna's (shRNA) te identificeren, uitgedrukt uit recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren (rAAVs), om de drempel van shRNA-expressie te identificeren die voorafgaand aan de lever kan worden getolereerd toxiciteit die gepaard gaat met overmatige shRNA-expressie6. Met dit protocol identificeerden we ook Microrna's in de lever die reageren op de afwezigheid van microRNA-122-een sterk uitgedrukt hepatisch microRNA-terwijl het afbraak patroon van deze microRNA7ook kenmerkend is. Omdat we ons protocol consequent in tal van experimenten hebben gebruikt, hebben we de voorbereidingen in de lengterichting in de lengterichting kunnen observeren en zien dat er geen waarneembare batch-effecten zijn.
Bij het delen van dit protocol is het ons doel om gebruikers in staat te stellen hoge kwaliteit, reproduceerbare kwantificering van Microrna's te genereren in vrijwel elke weefsel-of cellijn, met behulp van betaalbaar materiaal en reagentia, en gratis bioinformatica tools.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

De helft van alle menselijke transcripties wordt verondersteld te worden gereguleerd door microRNAs. Daarom kan het kwantificeren van de microRNA-uitdrukking onderliggende mechanismen in ziektetoestanden onthullen en therapeutische doelen en biomarkers bieden. Hier wordt gedetailleerd beschreven hoe u Microrna's nauwkeurig kwantificeren. In het kort beschrijft deze methode het isoleren van Microrna's, het ligeren ervan aan adapters die geschikt zijn voor sequentiëren met hoge doorvoer, het versterken van de eindproducten en het voorbereiden van een voorbeeld bibliotheek. Vervolgens leggen we uit hoe de verkregen sequentiëren leesbewerkingen kunnen uitlijnen op microRNA haarspelden, en kwantificeren, normaliseren en berekenen van hun differentiële uitdrukking. Veelzijdig en robuust, deze gecombineerde experimentele workflow en bio informatica analyse stelt gebruikers in staat om te beginnen met weefsel extractie en finish met microRNA kwantificering.

Schematische voorstelling van stappen bij de voorbereiding van bibliotheken Een algemene schematische voorstelling van kleine RNA-extractie,-sequencing en-uitlijning wordt beschreven in Figuur 2. Lever monsters van een mannelijke en een vrouwelijke muis werden verzameld en snap bevroren in vloeibare stikstof. Totaal RNA werd geëxtraheerd en geëvalueerd op kwaliteit en concentratie.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

We hebben een gedefinieerd, reproduceerbaar en langdurig protocol ontwikkeld voor kleine RNA-sequencing en voor het analyseren van genormaliseerde reads met behulp van opensource bioinformatica tools. De belangrijkste voordelen van onze strategie zijn dat het nauwkeurig microRNAs verzamelt door middel van gelzuivering en dat de bio-informatica analyse kan worden toegepast, ongeacht hoe de microRNAs worden verzameld. Hoge doorvoer sequencing van microRNAs kan onthullen inzicht in ziektemechanismen, de verwerking van microRNAs, en de nauwkeurige kwantificering van gentherapie benaderingen die kleine RNAs leveren.Zorg ervoor dat u werkt in een RNase vrije omgeving en om alle RNA-producten op ijs te houden tijdens de procedure. Het visualiseren van de gel snijden stappen zal kijkers helpen om de juiste grootte van de producten die nodig zijn voor downstream-toepassingen te identificeren. Voor drie prime adapter ligatie, combineren 11 microliter RNA met 1,5 microliter atp vrije 10X T4RNA ligase reactie buffer, een microliter van polyethyleenglycol, en 0,5 microliter van drie prime linker.Verwarm de monsters op 95 graden Celsius op een thermocycler gedurende 30 tot 40 seconden, gevolgd door een minuut afkoelen op ijs. Voeg een microliter T4RNA ligase twee toe en broed de reactie twee uur lang bij kamertemperatuur uit. Terwijl de monsters zijn uitbroeden, giet een 15%polyacyrilamide gel tussen 0,8 millimeter gescheiden glasplaten in een plastic giet en steek een kam.Wanneer de gel gestold is, voeg dan 0,5 5X TBE toe aan de tank en pipet krachtig om de putten van restureum te wassen. Na het voorlopen van de polyacrylamide gel gedurende 25 minuten op 375 volt, laad de monsters waardoor ten minste een rijstrook tussen elk monster. Laad 20 microliter van ten minste twee sets markers in een asymmetrisch patroon om de geloriëntatie bij te houden en de gel op een constante 375 volt uit te voeren.Na 15 minuten, verhogen tot een constante 425 volt voor de rest van de run en voer de gel voor ongeveer twee uur. Gebruik aan het einde van de run een plaatafscheider om de gel van de glasplaten te verwijderen en leg de gel op een plastic paginabeschermer. Verdun vijf microliter ethidium bromide in 500 microliter gedestilleerd water en voeg de kleurstof toe aan de markerbanen net boven de bovenste lichtblauwe marker.Gebruik vervolgens een schoon scheermesje om de gels van de bovenste naar de onderste markering in elke rijstrook onder ultraviolet licht te snijden en de stukken over te brengen naar een vierkant van vier bij vier centimeter van de laboratoriumafdichtingsfilm. Snijd de gel met ongeveer drie bezuinigingen horizontaal en twee bezuinigingen verticaal tot 12 kleine vierkantjes te produceren. Voeg 400 microliter natriumchloride van 0,3 moler aan de afdichtingsfilm toe en leid de gelstukken in 1,5 milliliter siliconen buizen.Roer de monsters op een nutator op vier graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, breng 400 microliters van elke supernatant in nieuwe buizen. Voeg een milliliter van 100% ethanol en een microliter van 15 milligram per milliliter glycogeen co-precipitant per buis.Bewaar vervolgens de buizen op min 80 graden Celsius gedurende een uur. Voor vijf prime linker ligatie, eerst spin vaststelling van de ontdooide monsters en resuspend de pellets in water. Voeg vervolgens 0,5 microliter van 100 micromolar vijf prime linker, een microliter T4RNA ligase buffer, een microliter van 10 millimolar ATP, en een microliter van polyethyleenglycol aan elk monster.Verwarm de reacties op 90 graden Celsius gedurende 30 seconden voordat ze op ijs worden gezet. Voeg vervolgens een microliter T4RNA-ligase toe aan elke buis en broed de reacties twee uur lang bij kamertemperatuur uit. Voor omgekeerde transcriptie, verzamel de monsters door centrifugatie en resuspend de lucht gedroogde pellet in 8,25 microliters van nuclease gratis water.Voeg 0,5 microliter van 100 micromolar reverse transcriptase primer en vijf microliters van 2X reverse transcriptase reactie mix van een aanvullende DNA synthese kit. Voeg na drie minuten bij 42 graden Celsius 1,5 microliter 10x reverse transcriptase enzym toe aan elk monster gedurende een incubatie van 30 minuten bij 42 graden Celsius in een thermocycler. Bereid na neutralisatie een PCR-reactie voor met 29,5 microliter water, vijf microliter van 10X taq buffer, een microliter van nucleoside triphosfat, twee microliters van 25 micromolar forward primer, twee microliters van 25 micromolar reverse primer, 0,5 microliter taq polymerase, en 10 microliter van de omgekeerde getranscribeerd complementaire DNA.Voer dan twee PCR-reacties uit. Voor agarose gel zuivering, bereiden een 4%agarose gel met een laag smeltende agarose en belasting 40 microliters of meer van de PCR product op de gel met lading kleurstof en 100 base pair en 25 base pair size markers. Na het uitvoeren van de gel, snijd de band boven de 125 base pair band en gebruik een gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.Schud om de gelband in buffer op kamertemperatuur op te lossen voordat u de juiste apparatuur gebruikt om de uiteindelijke sequentiebibliotheek te kwantificeren. Gebruik vervolgens de juiste opensource bioinformatica tools om de sequentiegegevens te analyseren. In deze representatieve PCR-reactie op laag smeltende agarose gel kan de verwerving van het juiste gekloonde product ten opzichte van het verkregen linker linkerproduct en onverzadigde versus verzadigde monsters worden waargenomen.Na uitlijning op menselijke microRNA haarspelden, een sterke concordantie tussen de microRNA lezen telt in elke replicate kan worden waargenomen. Een totaal van 306 microRNA soorten werden gedetecteerd met het grootste aantal reads mapping naar microRNA 122. Het is belangrijk om te onthouden om de gels te snijden op de juiste grootte om een nauwkeurig herstel van de microRNAs mogelijk te maken.Na het sequencing van de microRNAs kunnen gebruikers een bioinformaticaanalyse toepassen om de distributie van microRNAs in hun weefsels van belang te karakteriseren. Deze techniek is gebruikt om te bepalen hoe microRNAs worden verwerkt en welke sets van microRNAs worden gewijzigd in bepaalde vormen van kanker. Zorg ervoor dat u voorzichtig te oefenen bij de behandeling van de ethidium bromide en bij het kijken naar de gels onder ultraviolet licht.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Genetics

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Next-generation Sequencing en Bioinformatics pijpleiding om te evalueren van genetische determinanten van constitutionele ziekte gericht

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massa spectrometrie gebaseerde Proteomics Analyses met behulp van de OpenProt Database te onthullen nieuwe eiwitten vertaald uit niet-canonieke Open lezing Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...