Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

Vi skulle vilja tacka medlemmarna i laboratorierna för Andrew Fire och mark Kay för vägledning och förslag.

Djurförsök bemyndigades av den institutionella djuromsorg-och bruk kommittén av universitetar av Washington.
Beredning av små RNA-bibliotek
1. RNA-isolering
<ol><li>Isolera RNA från en biologisk källa med hjälp av en standard RNA-isoleringsreagens, eller ett kit som berikar för mikroRNAs. För vävnader är det bäst att börja med prover Snap-fryst i flytande kväve och marken till ett pulver med hjälp av en pre-kyld murbr...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

Trots identifieringen av mikroRNAs över 20 år sedan13, är processen med mikroRNA sekvensering fortfarande mödosam och kräver specialiserad utrustning, hindrar laboratorier från att rutinmässigt anta egna protokoll14. Andra tekniker kan samtidigt utvärdera microRNAs, som mikroRNA Microarrays och multiplexerade Expression paneler; dessa tillvägagångssätt är dock begränsade eftersom de endast kvantifierar de mikroRNAs som finns i deras sond uppsättning. På grund...

Först upptäcktes i 19931, är det nu uppskattas att nästan 2000 mikroRNAs finns i den mänskliga arvsmassan2. MicroRNAs är små icke-kodning RNAs som typiskt 21-24 nukleotider lång. De är post-transkriptionella regulatorer av genuttryck, ofta bindande för kompletterande platser i 3-icke översatt region (3-UTR) av målgener att förtrycka proteinuttryck och försämra mRNA. Kvantifiering av mikroRNAs kan ge värdefull insikt i genuttryck och flera protokoll har utvecklats för detta ändamål3.
Vi har utvecklat en definierad, reproducerbar och lång-stående protokoll för små RNA sekvensering, och för att analysera normaliserade läsningar med öppen källkod bioinformatik verktyg. Viktigt, vårt protokoll möjliggör samtidig identifiering av både endogena mikroRNAs och exogent levererade konstruktioner som producerar mikroRNA-liknande arter, samtidigt som man minimerar läsningar som mappas till andra små RNA-arter, inklusive ribosomal RNAs ( rRNAs), överföra RNA-härledda små RNAs (tsRNAs), upprepade små RNAs-och mRNA-nedbrytningsprodukter. Som tur är är microRNAs 5-fosforylerade och 2-3 hydroxylerade4, en funktion som kan utnyttjas för att separera dem från dessa andra små rnas-och mRNA-nedbrytningsprodukter. Flera kommersiella alternativ finns för mikroRNA kloning och sekvensering som ofta är snabbare och enklare att multiplex; men den egenutvecklade karaktären av kit reagens och deras frekventa ändringar gör att jämföra prov körningar utmanande. Vår strategi optimerar insamlingen av endast den korrekta storleken av microRNAs genom akrylamid och agaros gel reningssteg. I detta protokoll beskriver vi också en procedur för att justera sekvensläsningar till microRNAs med hjälp av Open source-verktyg. Denna uppsättning instruktioner kommer att vara särskilt användbart för nybörjare informatikanvändare, oavsett om vårt bibliotek förberedelse metod eller en kommersiell metod används.
Detta protokoll har använts i flera publicerade studier. Till exempel, det användes för att identifiera mekanismen genom vilken Dicer enzymet klyver små hårnål RNAs på ett avstånd av två nukleotider från den inre slingan av stammen-loop struktur-den så kallade "loop-Counting regel"5. Vi följde också dessa metoder för att identifiera den relativa överflöd av levererade små hårnål RNAs (shRNA) uttryckt från rekombinanta Adeno-associerade virala vektorer (rAAVs), att identifiera tröskeln till shRNA uttryck som kan tolereras före levern toxicitet i samband med överskott shRNA uttryck6. Med hjälp av detta protokoll identifierade vi också mikroRNAs i levern som svarar på frånvaron av mikroRNA-122-en starkt uttryckt hepatisk mikroRNA-samtidigt som den karakteriserar nedbrytnings mönstret för denna microRNA7. Eftersom vi har använt vårt protokoll konsekvent i många experiment, har vi kunnat observera prov preparat i längsled, och se till att det inte finns några märkbara batcheffekter.
Genom att dela detta protokoll är vårt mål att göra det möjligt för användare att generera högkvalitativ, reproducerbar kvantifiering av mikroRNAs i praktiskt taget vilken vävnad eller cell linje som helst, med hjälp av prisvärd utrustning och reagenser och gratis bioinformatikverktyg.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

Hälften av alla mänskliga transkriptioner tros regleras av microRNAs. Därför kan kvantifierande mikroRNA uttryck avslöja bakomliggande mekanismer i sjukdomstillstånd och ge terapeutiska mål och biomarkörer. Här specificerar vi hur man exakt kvantifierar mikroRNAs. Kortfattat, denna metod beskriver isolera mikroRNAs, ligating dem till adaptrar som lämpar sig för hög dataflöde sekvensering, förstärkning av slutprodukterna, och förbereda ett prov bibliotek. Sedan förklarar vi hur man justerar de erhållna sekvenseringen läsningar till mikroRNA hårnålar, och kvantifiera, normalisera, och beräkna deras differential uttryck. Mångsidig och robust, detta kombinerade experimentella arbetsflöde och bioinformatiska analys gör det möjligt för användare att börja med vävnads extraktion och avsluta med mikroRNA kvantifiering.

Schematiskt av steg involverade i biblioteks förberedelse En övergripande Schematisk liten RNA-extraktion, sekvensering och justering beskrivs i figur 2. Leverprover från en hane och en kvinnlig mus samlades in och snäpper fryst i flytande kväve. Totalt RNA extraherades och utvärderades för kvalitet och koncentration.
Liten RNA-sekvensering ger tillräckligt med...

Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Här beskriver vi en steg-för-steg-strategi för att isolera små RNAs, berika microRNAs och förbereda prover för sekvensering med höga dataflöden. Sedan beskriver vi hur du bearbetar sekvensläsningar och anpassar dem till microRNAs med hjälp av verktyg med öppen källkod.

En komplett pipeline för att isolera och sekvensera mikroRNAs, och analysera dem med hjälp av Open source-verktyg

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Vi har utvecklat ett definierat, reproducerbart och långvarigt protokoll för små RNA-sekvensering och för att analysera normaliserade läsningar med hjälp av opensource bioinformatikverktyg. De största fördelarna med vår strategi är att den exakt samlar in mikroRNA genom gelrening och att bioinformatikanalysen kan tillämpas oavsett hur mikroRNA samlas in. Hög genomströmning sekvensering av microRNAs kan avslöja insikt i sjukdomar mekanismer, bearbetning av microRNAs, och korrekt kvantifiering av genterapi metoder som levererar små RNAs.Se till att arbeta i en RNase fri miljö och att hålla alla RNA produkter på is under hela förfarandet. Visualisera gel skärande steg kommer att hjälpa tittarna att identifiera rätt storlek på de produkter som krävs för nedströms applikationer. För tre främsta adaptor liger, kombinera 11 mikroliter av RNA med 1,5 mikroliter av ATP fri 10X T4RNA ligase reaktion buffert, en mikroliter av polyetylenglykol, och 0,5 mikroliter av tre främsta länkare.Värm proverna vid 95 grader Celsius på en termocyklare i 30 till 40 sekunder, följt av kylning på is i en minut. Tillsätt en mikroliter T4RNA ligase två och inkubera reaktionen i rumstemperatur i två timmar. Medan proverna inkuberar, häll en 15%polyacyrilamid gel mellan 0,8 millimeter separerade glasplattor i en plast gjuten och sätt in en kam.När gelen har stelnat, tillsätt 0,5 5X TBE till tanken och pipetteras kraftigt för att tvätta brunnarna i kvarvarande urea. Efter att förkört polyakrylamidgelen i 25 minuter vid 375 volt, ladda proverna som lämnar minst ett körfält mellan varje prov. Ladda 20 mikroliter av minst två uppsättningar markörer i ett asymmetriskt mönster för att hålla reda på gelorienteringen och kör gelen vid en konstant 375 volt.Efter 15 minuter, öka till en konstant 425 volt för resten av körningen och kör gelen i cirka två timmar. I slutet av körningen, använd en plåtavskiljare för att ta bort gelén från glasplattorna och placera gelen på ett sidaskydd av plast. Späd fem mikroliter ethidiumbromid i 500 mikroliter av destillerat vatten och tillsätt färgämnet på markörbanorna strax ovanför den övre ljusblå markören.Därefter använder du ett rent rakblad för att skära gelerna från den övre till nedre markören i varje körfält under ultraviolett ljus och överföra bitarna till en fyra med fyra centimeter kvadrat av laboratoriets tätningsfilm. Skär gelen med cirka tre snitt horisontellt och två snitt vertikalt för att producera 12 små rutor. Tillsätt 400 mikroliter 0,3 molar natriumklorid på tätningsfilmen och styr gelbitarna i 1,5 milliliter siliconized rör.Agitera proverna på en mutter vid fyra grader Celsius över natten. Nästa morgon, överför 400 mikroliter av varje supernatant till nya rör. Tillsätt en milliliter av 100%etanol och en mikroliter av 15 milligram per milliliter glykogen co-precipitant per rör.Förvara sedan rören på minus 80 grader Celsius i en timme. För fem främsta länkare liger, först snurra ner de tinade proverna och resuspend pellets i vatten. Därefter lägger du till 0,5 mikroliter av 100 mikromolar fem främsta länkare, en mikroliter av T4RNA ligase buffert, en mikroliter på 10 millimolar ATP och en mikroliter av polyetylenglykol till varje prov.Värm reaktionerna vid 90 grader Celsius i 30 sekunder innan du placerar dem på is. Tillsätt sedan en mikroliter T4RNA ligase en till varje rör och inkubera reaktionerna i rumstemperatur i två timmar. För omvänd transkription, samla in proverna genom centrifugeringen och resuspend luften torkade pelleten i 8,25 mikroliter av nukleas fritt vatten.Lägg till 0,5 mikroliter av 100 mikromolar omvänd transkriptas primer och fem mikroliter av 2X omvänd transkriptas reaktion mix från en kompletterande DNA-syntes kit. Efter tre minuter vid 42 grader Celsius, tillsätt 1,5 mikroliter av 10X omvänd transkriptas enzym till varje prov för en 30 minuters inkubation vid 42 grader Celsius i en thermocycler. Efter neutralisering, förbereda en PCR-reaktion med 29,5 mikroliter vatten, fem mikroliter av 10X taq buffert, en mikroliter av nukleosidtrifosfat, två mikroliter av 25 mikromolar framåt primer, två mikroliter av 25 mikromolar omvänd primer, 0,5 mikroliter av taq polymeras och 10 mikroliter av omvänd transkriberas kompletterande DNA.Kör sedan två PCR reaktioner. För agarosgelrening, preparera en 4%agarosgel med låg smältningsagarn och ladda 40 mikroliter eller mer av PCR-produkten på gelen med lastningsfärgämne och 100 baspar och 25 basparstorleksmarkörer. När du har kört gelen, skär bandet ovanför 125 basparbandet och använd en sats för gelutvinning enligt tillverkarens anvisningar.Skaka för att lösa upp gelbandet i buffert vid rumstemperatur innan lämplig utrustning används för att kvantifiera det slutliga sekvensbiblioteket. Använd sedan lämpliga opensource bioinformatik verktyg för att analysera sekvensdata. I denna representativa PCR-reaktion på lågsmälta agarosgel kan man observera förvärvet av den korrekta klonade produkten jämfört med den erhållna linker-linkerprodukten och omättade kontra mättade prover.Efter anpassning till mänskliga microRNA hårnålar, en stark konkordans mellan microRNA läsa räknas i varje replikat kan observeras. Totalt 306 mikroRNA arter upptäcktes med det största antalet läsningar kartläggning till microRNA 122. Det är viktigt att komma ihåg att skära gelerna i lämplig storlek för att möjliggöra en korrekt återhämtning av microRNAs.Efter sekvensering av microRNAs, användare kan tillämpa en bioinformatik analys för att karakterisera fördelningen av microRNAs inom deras vävnader av intresse. Denna teknik har använts för att identifiera hur mikroRNA bearbetas och vilka uppsättningar av microRNAs ändras i vissa cancerformer. Var noga med att utöva omsorg vid hantering av ethidiumbromiden och när du tittar på gelerna under ultraviolett ljus.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Genetics

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Riktade nästa generations sekvensering och bioinformatik Pipeline för att utvärdera genetiska determinanter av konstitutionella sjukdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detektion av sällsynta händelser med fel-korrigerade DNA och RNA-sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En snabb och lättköpt Pipeline för generera genomisk punkt mutanter i C. elegans med CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralåga ingående Genome Sequencing bibliotek förberedelse från enda Tardigrade prov

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolera, sekvensering och analysera extracellulära mikroRNA från humana mesenkymala stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA från helblod med Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Mass Spectrometry-baserad proteomik analyser med hjälp av databasen OpenProt att avslöja nya proteiner översatt från icke-kanoniska öppen läsning ramar

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...